Tema 10. VALORACIÓN DE RESULTADOS. Métodos alternativos a la Experimentación Animal Tema 10. VALORACIÓN DE RESULTADOS.

Relación dosis-respuesta Base para la evaluación del peligro y el riesgo

FORMAS DE DETERMINAR LA TOXICIDAD Efectos bioquímicos Modificaciones fisiológicas Alteraciones reproductivas Muerte: DL50 NOEC PRINCIPIOS ESTADÍSTICOS Diseño experimental Muestreo Modelización Recolección de datos Las pruebas y las metodologías Interpretación de los resultados EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

Análisis de relaciones Dos o más variables Análisis de regresión Selección de la ecuación matemática (el modelo) Depende del tipo de variables Las variables CUALITATIVAS Discretas (números enteros) CUANTITATIVAS Continuas (números reales) Regresión Cuantitativamente EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención. Regresión

MODELOS MATEMÁTICOS EN EL ANÁLISIS DE RELACIONES MECANÍSTICO Describir un proceso basándose en postulados acerca de la mecánica de dicho proceso EMPÍRICO O DESCRIPTIVO Describir cuantitativamente los patrones de las observaciones sin basarse en los procesos subyacentes o mecánica del proceso DETERMINÍSTICO O NO ESTOCÁSTICO Dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo es siempre el mismo valor PROBABILÍSTICO O ESTOCÁSTICO Dado un dato en particular, la predicción que se obtiene del modelo es un valor variable

DISEÑOS DE EXPERIMENTOS DE TOXICIDAD MÉTODOS ESTADÍSTICOS Necesarios para la validez y precisión de las pruebas Sobre diseño, planificación, ejecución y análisis de resultados Seleccionar un método estadístico sencillo ajustado a las condiciones experimentales que permita obtener resultados válidos DISEÑOS DE EXPERIMENTOS DE TOXICIDAD Nº razonable de repeticiones Aleatorización de las dosis Existencia de un control necesario para estimar el error experimental EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

DISEÑO Y EJECUCIÓN DE ENSAYOS DE TOXICIDAD ELEMENTOS ESTADÍSTICOS PARA EL DISEÑO - UNIDAD EXPERIMENTAL - RESPUESTA (punto final) Observación, medición, identificación - CONDICIONES PARA LA EVALUACIÓN Tamaño de la población, ensayo de supervivencia en paralelo - GRUPOS DE TRATAMIENTO Dosis-respuesta, controles, varias muestras individuales - FUENTES DE VARIABILIDAD (dentro y entre ensayos) - FUENTES DE SESGOS - MÉTODOS DE EVALUACIÓN ESTADÍSTICA EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

ELEMENTOS ESTADÍSTICOS PARA EL DISEÑO - FUENTES DE VARIABILIDAD (dentro y entre ensayos) DENTRO DE LOS ENSAYOS ENTRE ENSAYOS ¿reproducibilidad? Errores en diluciones Imprecisiones en el pesado Errores al medir volúmenes Errores en el conteo Variación biológica (genética, fisiológica) Etc Las propiedades físicas y químicas de los agentes Almacenamiento y preparación Cambios en las condiciones de cultivo de los organismos Cambios históricos en el protocolo Cambios en el personal del laboratorio Cambios genéticos en el material biológico EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

Reproducibilidad o replicabilidad Propiedades físicas y químicas de los compuestos conocidas y controladas Preparación y almacenamiento de los compuestos, solventes y diluciones controlados Manejo y uso de los organismos prueba (animales, células) Número de repeticiones del ensayo Número de tratamiento/grupos de dosis Intervalos de las dosis Selección de controles ALEATORIZACIÓN EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

DISEÑOS MÁS COMUNES EN LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD Establecimiento de la relación dosis-respuesta Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados o expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0) TIPOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE RESULTADOS Paramétricos No paramétricos Suposiciones y/o estimaciones acerca de los parámetros de las distribuciones probabilísticas de la variable EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

Establecimiento de la relación dosis-respuesta Obtener las estimaciones de los parámetros del modelo seleccionado para relacionar las variables. Y utilizar el modelo con las estimaciones de los parámetros encontrados para determinar los valores de la variable concentración de tóxico que causan un grado de efecto sobre los organismos expuestos. concentración ¿………? Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico) - De tipo mortalidad Análisis de regresión y análisis Probit (paramétrico) Método de Spearman-Kärber (no paramétrico) Método gráfico De tipo inhibición del crecimiento (variable cuantitativa continua) EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

- De tipo mortalidad (Estimación de CL50, CE50 , CI50) Probit Dos o más mortalidades No Sí Litchfield-Wilcoxon No No ¿Adecuación del modelo? ¿Significación estadística? ¿Una o más mortalidades parciales? Método gráfico CL50 Spearman-Kärber Sí Sí Método gráfico ¿Mortalidad nula en la CE más baja y letalidad total en la más alta? No Método Probit Sí Método de Sperman-Karber Método de Sperman-Karber ajustado CL50 e intervalo de confianza al 95%

- De tipo mortalidad Análisis de regresión y análisis Probit (paramétrico) • Concentración de la sustancia o dosis (d). • Número de individuos (n). • Número de organismos muertos o afectados (r). • Porcentaje de efecto (p). p = (r/n) x100 Transformación a escala logarítmica X = log10(d) tablas de Probit p (porcentaje de efecto) unidades probit

DETERMINACIÓN DE CL50, CE50, CI50 - De tipo mortalidad Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico) Construcción de un gráfica a partir de los datos de las pruebas de toxicidad aguda Mediante el uso de la recta trazada se obtiene en el eje logarítmico la concentración correspondiente al 50% del efecto observado sobre el eje probabilístico DETERMINACIÓN DE CL50, CE50, CI50 Log X

- De tipo mortalidad Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico) - Obtener las concentraciones de 16, 50 y 84% Calcular la pendiente de la recta (S): Calcular el número de individuos (N) en los que se observó porcentaje de efecto entre 16 y 84% Calcular el exponente E y con él calcular el factor fCL50. CALCULAR EL INTERVALO DE CONFIANZA CÁLCULO DEL INTERVALO DE CONFIANZA CL84 /CL50 + CL50 /CL16 S = 2 2,77 E = N’ f CL50 = SE (CL50) (fCL50) = límite superior al 95% de confianza (CL50/Fcl50) = límite inferior

- De tipo mortalidad Método de Spearman-Kärber (no paramétrico) Proporciona una buena estimación de la media y la desviación estándar CL50 = m =Xk – d (S1 – ½) Xk = dosis mínima a partir de la cual todas las reacciones son del 100%. d = distancia entre cada dos dosis. S1 = suma de las fracciones de individuos que presentaron reacción. Sn = 2S2 – S1 – S12 – 1/12 S2 = suma de la fracción acumulada de los individuos que presentaron reacción.

- De tipo inhibición de crecimiento VARIABLE CUANTITATIVA CONTINUA Estimación de la relación D-R con métodos de regresión Transformación de la concentración a logaritmos para obtener una distribución normal - Transformación de variable respuesta en función de la distribución

2- Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0) Para la determinación del NOEC y del LOEC Implica pruebas de hipótesis ANOVA seguido de la prueba a posteriori de Dunnet. REQUISITOS: - Supuestos de ANOVA: Varianzas homogéneas (Ej. Prueba de Barlett o de Levenne) Independencia de errores Distribución normal de los residuos (Prueba de Shapiro-Wilk) - Nº de replicados por tratamiento sea > 3 (OBLIGATORIO) - Todos los tratamientos tengan el mismo número de replicados EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención. Prueba de t con ajuste de Bonferroni

Pruebas para evaluar la diferencia entre grupos tratados expuestos a distintas dosis contra un control negativo (dosis 0) Si no se verifican los supuestos de ANOVA: Transformar la variable dependiente (respuesta) hasta obtener una que verifique dichos supuestos Aplicar métodos no paramétricos Kruskal-Wallis Mann-Whitney Wilcoxon con ajuste de Bonferroni EL DISEÑO EXPERIMENTAL Consideraciones -Hipótesis de trabajo: nos haremos preguntas concretas sobre el experimento, su objetivo/s y su desarrollo. No conviene realizar más de tres o cuatro preguntas. -Antecedentes: comprobaremos si el experimento que vamos a realizar ha sido publicado con anterioridad; así como trabajos similares y/o relacionados. -Elección de modelos: existen protocolos recomendados para determinados proyectos, además hay normas internacionales como I.S.O. u O.C.D.E. La selección del modelo es un paso crítico en el diseño experimental. -Metodología: debemos plantear un método adecuado para el experimento que vamos a realizar, siempre acorde con nuestras posibilidades logísticas y técnicas. -Resultados: son los datos que obtenemos de nuestro trabajo. -Conclusiones: llegamos a ellas gracias a la interpretación de los datos obtenidos. -Extrapolación y validación: una interpretación crítica de los resultados nos permitirá comprobar su validez. Para ello debemos tener en cuenta los posibles fallos que hemos podido cometer y hacerlos constar en nuestras conclusiones. Para que los resultados sean extrapolables es necesario que nos hayamos ajustado a normas internacionales en cuanto a su expresión y el método de obtención.

Referencias Díaz Baez, M.C., Bulus Rossini, G.D., Pica Granados, Y. 2004. Métodos Estadísticos para el Análisis de Resultados de Toxicidad. En ENSAYOS TOXICOLÓGICOS Y MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE CALIDAD DE AGUAS: Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. http://web.idrc.ca