ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Reacción con o-ftalaldehído (Fluorimétrica) Reacción de la ninhidrina (espectrofotométrica) Cromatografía de intercambio catiónico Actualmente: HPLC

Cromatografía en capa fina (aminoácidos)

PURIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS Suspensión de Células ó tejidos: Ultrasonidos Detergente Émbolo rotatorio (potter ó aspas) Homogenado FRACCIONAMIENTO DEL HOMOGENADO CELULAR Centrifugación a baja velocidad Homogenado celular PRECIPITADO 1 Células enteras, núcleos, citoesqueleto Velocidad media 20000g, 20min 1000g, 10 min Velocidad alta 80000g, 1h Velocidad muy alta 150000g, 1h SOBRENADANTE 1 2 3 PRECIPITADO 2 mitocondrias, lisosomas, peroxisomas PRECIPITADO 3 Microsomas, otras vesículas pequeñas PRECIPITADO 4 Ribosomas,virus macromoléculas CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA Fraccionamiento Muestra Gradiente de sacarosa Componente menos denso Componente mas denso http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Se basa en la diferente: Solubilidad Tamaño Carga eléctrica Densidad Afinidad por otras moléculas

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Las diferentes proteínas se retrasan según sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o unión a grupos químicos Muestra aplicada El solvente se aplica contínuamente a la boca de la columna Matriz sólida Tapón poroso Tubo de ensayo tiempo Moléculas fraccionadas eluídas y recogidas http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

TRES CLASES DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA A) Intercambio iónico: en base a la carga Depende del pH y de la fuerza iónica B) Filtración en gel: en base al tamaño C) de Afinidad: Flujo de solvente Partícula cargada positivamente Molécula cargada negativamente unida Molécula cargada positivamente libre Partículas porosas Molécula pequeña retrasada Molécula grande no retrasada Partícula con sustrato unido covalentemente Molécula de enzima unida Otras proteínas pasan de largo http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

A: CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (Ej: intercambio catiónico) Las proteínas se separan según su carga a un pH determinado

Las proteínas se separan según su tamaño B: CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN O EXCLUSIÓN MOLECULAR Las proteínas se separan según su tamaño

C: CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Las proteínas se separan en función de la especificidad de unión a un ligando. En este ejemplo el ligando es la glucosa y se separan aquellas proteínas que se unen a ella. Las proteínas de interés se eluyen añadiendo un exceso de ligando libre.

ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

ELECTROFORESIS EN GEL Electroforesis en SDS-PAGE (solubiliza Tras aplicar un campo eléctrico las proteínas migran en función del tamaño y de la carga (solubiliza proteínas) http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

Ejemplo de análisis de proteínas por SDS-PAGE en cada paso de una purificación. En el último paso hay una única banda, lo que indica que tenemos la proteína de interés completamente purificada

ISOELECTROENFOQUE Es un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un gradiente de pH. Cada proteína migra hasta su punto isoeléctrico. http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html

Ejemplo de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie Marcador de PM Marcador de PM

GELES BIDIMENSIONALES (2D) Primero isoelectroenfoque y luego SDS-PAGE

Ejemplo de gel bidimensional

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Se basa en la diferente: Solubilidad Tamaño Carga eléctrica Densidad (centrifugación) Afinidad por otras moléculas

FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIÓN DE LA SOLUBILIDAD (p.e. sulfato de amonio) (Voet)

(Voet)