Géneros de Bacilos gram positivos aerobios o anaerobios facultativos esporulados N° de especies Especies principales Bacillus Paenibacillus Brevibacillus Aneurinibacillus Alicyclobacillus Virgibacillus Amphibacillus Sporolactobacillus Halobacillus Gracilibacillus Salibacillus > 60 20 10 2 3 1 B. antrhacis B. cereus P. alvei P. larvae P. macerans P. polimyxa P. pulvifaciens B. brevis B. laterosporus A. aneurinolyticus A. migulanus A. acidocaldarius A. acidoterrestris A. cycloheptanicus A. pantothenticus A. xylanus S. imilinus S. salexigens

Bacilos gram positivos regulares Esporas + Bacillus spp Esporas - BGP regulares catalasa + Metabolismo - SH2 (TSI) Oxidativo Kurthia spp Fermentativo Listeria spp - Lactobacillus spp + Erysipelothrix

Género Bacillus BGP regulares esporulados Aerobios o anaerobios facultativos Catalasa usualmente + Motilidad + por flagelos peritricos (mayoría de las especies) Metabolismo fermentativo o respiratorio Crecen en amplios rangos de temperatura (hasta 75°C) y pH (2 a 10) Colonias grandes, grises o blancas, de bordes irregulares, con b hemólisis (B. anthracis no presenta b hemólisis) Hábitat: suelo, agua, polvo. Algunas especies forman parte de la flora normal del intestino humano y de animales

Coloración de Gram B. cereus

B. mycoides

B. mycoides

Bacillus sp

Bacillus spp Habitat natural  Medio Ambiente: suelo de todo tipo clima cálido - frío áreas fértiles - desiertos agua dulce - salada  Esporos: Pueden permanecer por muchos años en el ambiente inanimado (esporas de Pasteur > 70 años) Son resistentes al calor (10 5 más veces que su forma vegetativa), a la irradiación (7 a 50 veces más que la forma vegetativa) y a algunos agentes químicos Pueden pasar del medio ambiente a otros habitats alimentos secos (leche en polvo, especias, farináceos)

Bacillus spp. Patogenicidad  Patógeno obligado: Bacillus anthracis  Patógenos oportunistas: la mayoría de las especies  Débil poder patogénico  Requieren tanto de una puerta de entrada como de un sistema inmune comprometido para producir enfermedad  Tipo de infección predominante (excluyendo la bacteriemia): la neumonía, muchas veces con complicaciones sépticas  Modo de transmisión: por inhalación de esporas  Especies más frecuentes: 1° B. cereus, 2° B. subtilis. Otras especies (menos frecuentes): B. circulans, B. pumilis, B. licheniformis, B. coagulans, B. sphaericus

Bacilos gram positivos esporulados, aeróbicos lecitinasa + B. cereus B. anthracis B. thurigiensis B. mycoides Motilidad + B. cereus B. thurigiensis - B. anthracis B. mycoides Cristales paraesporales de toxina con acción insecticida Salicina / glicerol - / - B. anthracis (g hemólisis colonia lisa) + / + B. mycoides (b hemólisis colonia rugosa) + B. thurigiensis - B. cereus

Cell of B. thurigiensis containing a d-endotoxin crystalline inclusion (arrow) and a forespore (S)

Caracteres mínimos para diferenciar B. anthracis de B. cereus Morfología Motilidad Cápsula ß hemólisis Sensibilidad a penicilina Fermentación de salicina Bacilar, extremos rectangulares, cadenas largas - + S Bacilar, extremos redondeados, cadenas cortas + / - - +++ R +

Antrhax: Etiology

Anthrax  Etiología: Bacillus anthracis  Infección primaria en herbívoros (ganado, ovejas, cabras, caballos) por ingestión de esporas del suelo.  Anthrax humano:  por contacto directo o indirecto (pelo, piel, lana) con el animal infectado: forma típica  por exposición intencional: forma atípica  Tres formas clínicas  Cutánea  Inhalatoria  Gastrointestinal  Transmisión hombre - hombre y animal - animal (misma especie) extremadamente infrecuente

Epidemiología del anthrax en el siglo XXI  Industrial por el procesamiento de productos animales contaminados: pelo, hueso, piel, lana (anthrax cutáneo e inhalatorio)  No industrial  Intencional / bioterrorismo por exposición inhalatoria y cutánea a esporas de B. anthracis (correspondencia) Por contacto directo con el animal infectado o su cadáver (anthrax cutáneo o gastrointestinal) Personal de laboratorio en contacto con esporas de B. anthracis (raro) Personal civil expuesto a productos animales importados contaminados (raro)

Anthrax cutáneo  Período de incubación: 1 – 12 días  Pápula vescículas úlcera necrótica negra (escara)  Pueden estar presentes edema y enrojecimiento  95 a 99 % de los casos de anthrax humano en el mundo  Mortalidad sin tratamiento ATB: 20 % con tratamiento ATB: 1 %

Anthrax cutáneo

Anthrax cutáneo

Lecitinasa

Anthrax respiratorio  Por exposición a piel, lana u otros productos animales contaminados con esporas (durante su procesamiento) o por exposición intencional (bioterrorismo)  Período de incubación: 1 - 7 días (hasta 42 días en algunos casos) 1- Cuadro inespecífico (“simil viral”): fiebre, mialgias, fatiga, tos, malestar y dolor de pecho 2- Mejoría de 2 ó 3 días 3- Hipoxia, disnea, shock séptico y muerte dentro de las 36 horas (fase final)  Hallazgos físicos no específicos  Rx de tórax: - ensanchamiento mediastinal - derrame pleural - mediastinitis hemorrágica necrotizante - ausencia de infiltrados pulmonares  Meningitis en el 50 % de los casos  Mortalidad sin tratamiento: 97 % con tratamiento: 75 %

Anthrax gastrointestinal  Por ingestión de carne contaminada insuficientemente cocida  Período de incubación: 1 - 7 días  Dolor abdominal + vómitos de sangre o diarrea, fiebre, ascitis masiva y signos de septicemia (fase final)  Ulceraciones orofaríngeas con adenopatía cervical y fiebre (algunos casos)  Mortalidad: 25 - 60 % (rol del tratamiento antibiótico precoz no establecido

Anthrax Toma de muestra  Anthrax cutáneo - Hisopado del exudado de las vescículas destechadas (lesiones tempranas) - Hisopado del borde de la escara sin remoción de la misma (lesiones tardías) - Hemocultivo: si hay presentes síntomas de infección sistémica  Anthrax gastrointestinal - Coprocultivo fase temprana - Hemocultivos fase tardía - Cultivo de líquido peritoneal y / o de aspiración de nódulos linfáticos, esplénicos o mesentéricos - Hisopado de fauces (lesiones orofaríngeas)  Anthrax respiratorio - Esputo si el paciente tiene tos productiva - Hemocultivos 2 a 8 días después de la exposición

Anthrax y Bioseguridad  Procesamiento de muestras clínicas  Manipulación del cultivo  Actividades que generan aerosoles  Procesamiento de muestras ambientales (esporos)  Actividades con la toxina  Dosis letal 50: 8000 - 40000 esporas BSL - 2 BSL - 3

Anthrax Procesamiento de muestras  Muestras clínicas no esporas (CO2 corporal inhibe la esporulación) no shock térmico  Muestras ambientales (polvo, pelo, hueso y suelo) presente en forma de esporas shock térmico (baño de agua a 65° C 10´) ó shock alcohólico (etanol 95 - 100%)  Siembra: agar sangre ovina (o agar chocolate) - agar feniletilalcohol (coprocultivo) - caldo tripticasa soya  Incubación: 35 - 37° C, atmósfera ambiente, 18 - 24 hs (crecimiento visible a partir de las 6 a 8 hs)  Esporulación Agar nutritivo con 5 mg de sulfato de manganeso Incubación: atmósfera ambiente Coloración de Gram ó Coloración de Verde de malaquita (Wirtz - Conklin)  Cápsula Agar nutritivo con 0.8 % de bicarbonato de sodio Incubación: 5 % CO2 Tinta china ó M´Fadyean Colonia sospechosa en 2.5 ml de sangre de caballo Incubación: 6 - 18 hs a 37° C Tinción de M´Fadyean

Criterios de laboratorio para la identificación de Bacillus anthracis Identificación presuntiva 1) A partir de la muestra clínica - Coloración de Gram: Bacilos gram positivos en cadenas cortas - Tinta china: cápsula + - Esporas: generalmente ausentes (a menos que la muestra sea expuesta al O2 atmosférico) 2) A partir del cultivo (AS ovina) - Gram: BGP no capsulados en cadenas largas - Verde de malaquita: esporas ovales, centrales o subterminales que no ensanchan la célula - Morfología colonial: colonia gris o blanca, adherente, lisa o ligeramente convexa con proyecciones en forma de coma desde el borde de la colonia (“cabeza de Medusa”) Cuando la colonia se levanta con el ansa tiene la apariencia de una yema de huevo batida - Inmóvil - No hemolítico - Lecitinasa + - Sensible a penicilina 10 U: 15 - 20 mm

Bacillus anthracis on agar

Bacillus anthracis colonial morphology

Bacillus anthracis spore and veg form-gram stain

Wound smear

Capsule formation of B. anthracis colonies incubated in a high CO2 environment

Criterios de laboratorio para la identificación de Bacillus anthracis Identificación definitiva  Presencia de la cápsula (Tinta china o M´Fadyean)  Sensibilidad (lisis) al fago gamma  Detección de anticuerpos (contra Ag capsular o polisacáridos de pared celular) por fluorescencia directa sobre el material clínico (DFA)  PCR para la toxina de B. anthracis  Inoculación ratón - cobayo (muerte)

Bacillus anthracis Factores de virulencia  Cápsula antifagocítica  Producción de 3 proteínas: - Antígeno protectivo (PA) - Factor letal (LF) - Factor edema (EF) a) PA + LF: exotoxina letal b) PA + EF: exotoxina edema a) + b) inhiben la función de los PMN y la fagocitosis

Bacillus anthracis Inmunización 1) Vacunas de células vivas: - Suspensiones de esporas vivas de cepas no capsuladas pero productoras de toxina - No aplicables en humanos - Tipos: “STERNE” “ STI” (vacuna rusa) “ Pasteur” (de virulencia reducida) 2) Vacunas acelulares: - Filtrado (enriquecido en PA) libre de células de un cultivo de B. anthracis (cepa V770-NP1-R) toxigénica, no capsulada) - Adyuvante: sulfato potásico de aluminio - AVA (Anthrax vaccine adsorbed): única vacuna autorizada en USA (Biopart Corporation Lansing Michigan) Efectivas para anthrax cutáneo (93 %) y para anthrax inhalatorio (estudios en animales) 3) Vacuna recombinante de PA usada con adyuvante (Al3+, saponina, manofosforil lípido A, Freund, etc.) En investigación

Profilaxis vacunal preexposicional Recomendaciones para su uso  Personal que trabaja en producción de cultivos de B. anthracis a gran escala o expuestos a aerosoles  Personal en contacto con productos animales importados (pelos, lana, pieles, huesos) en países en los que las restricciones de importación y los standares industriales son insuficientes para prevenir la exposición a las esporas de B. anthracis  Veterinarios y trabajadores de mataderos en áreas con alta incidencia de casos de anthrax  Población militar de Estados Unidos No se recomienda en los siguientes casos  Personal de laboratorio que trabaja con BSL-2  Población civil de países que han sufrido ataque de bioterrorismo debido a que no puede predecirse cual será la población “target” para el ataque ni puede calcularse el riesgo de exposición  Profilaxis vacunal post - exposicional administrada en forma aislada (sin ATB) no es protectiva

Manejo de la situación de exposición a B Manejo de la situación de exposición a B. anthracis en correspondencia (CDC) 1) Profilaxis ATB (doxycilina ó levofloxacina) para aquellos potencialmente expuestos 2) Tomar muestras ambientales: - Hisopados de superficies (cartas) - Hisopados nasales de las personas potencialmente expuestas (si  7 días) 3) Redefinir la lista de personas potencialmentes expuestas: - Si no expuestas detener el tratamiento - Si expuestas continuar el tratamiento por un total de 60 días

B. anthracis Sensibilidad antibiótica 65 cepas de colección del CDC 22 cepas de los atentados bioterroristas en USA  Número de cepas: 87  Método: microdilución en caldo  Interpretación: NCCLS (puntos de corte para Staphylococcus spp)  Resultados: Quinolonas Rifampicina Tetraciclina Clindamicina Cloranfenicol Aminoglucósidos Vancomicina Imipenem Meropenem I Macrólidos Cefalosporinas de amplio espectro (CRO) TMS S R 2 tipos de ß lactamasa: - Penicilinasa (clase A) inducible - Cefalosporinasa (clase B)

Anthrax Tratamiento antibiótico  ATB de elección: - Ciprofloxacina - Doxyciclina (no meningitis)  ATB alternativos: - Penicilina - Amoxicilina - ß lactamasa inducible puede activarse durante el tratamiento - Pobre penetración en macrófagos  Duración del tratamiento: 60 días Niños Embarazo Lactancia

Anthrax Epidemiología En Estados Unidos 18 casos de anthrax inhalatorio (hasta 1976) 1 caso de anthrax cutáneo en 1992 No casos de anthrax entre 1993 - 2000 - Por ataque bioterrorista (octubre - diciembre 2001 Anthrax inhalatorio 11 casos confirmados Anthrax cutáneo 7 casos confirmados 4 casos confirmados - Número de muertes: 5 (anthrax inhalatorio) - Fuentes de las esporas: correspondencia - Estados afectados: Nueva York, Nueva Yersey, Florida, Connectient y Columbia En Argentina (Buenos Aires) 1977 - 2000 83 casos de anthrax cutáneo 2 muertes (hasta 1991 no información oficial por fallecimiento) 50 kg de esporas de B. anthracis esparcidos sobre una población de 500000 habitantes pueden producir 95000 muertes y 125000 hospitalizaciones

B. cereus

B. cereus Patologías Intoxicación alimentaria 2 tipos de síndromes: a) Diarreico - Toxina termolábil (fabricada “in vivo”) - Diarrea 8 - 16 hs después de la ingestión de alimentos contaminados (carnes, vegetales, pastas, postres, salsas, leche) b) Emético - Toxina termoestable (preformada en el alimento) - Náuseas y vómitos 1 a 5 horas después de la ingestión de platos orientales con arroz, pastas, postres, fórmulas reconstituídas - Endoftalmitis postraumática (2° agente etiológico después de ECN) - Infecciones en pacientes inmunocomprometidos: bacteriemia, endocarditis, meningitis, hemorragia cerebral, neumonía, empiemia, pleuritis, absceso de pulmón, absceso cerebral, osteomielitis, salpingitis e infecciones cutáneas primarias - Infección de heridas postquirúrgicas, post-accidentes de tránsito, fijación de yesos y quemaduras

Bacillus spp Factores predisponentes para la bacteriemia  Neoplasias  Drogadicción EV  Hemodiálisis  Cateterización  Diabetes  Trauma  Neutropenia

Bacillus spp y Neoplasia  Bebe y Koneman, Clin. Microbiol. Rev. 1995  140 pacientes con bacteriemia: 63 (45 %) con algún tipo de neoplasia (leucemia, linfoma, mieloma múltiple y carcinoma  Especies más frecuentes. B. cereus y B. subtilis  Mayor condición predisponentes: la neutropenia  Puerta de entrada más frecuente: uso de catéteres EV  La mayoría de los pacientes: hospitalizados

Bacilos gram positivos esporulados: cuando jerarquizarlos y otras consideraciones  Cuando se los aisla en cultivo puro o como flora predominante en muestras con bacterioscopía +  Cuando el aislamiento proviene de un material noble (sangre, LCR)  Cuando el aislamiento es relevante desde el punto de vista clínico  Cuando se repite el aislamiento en un 2° especimen clínico  La infección ocular por B. cereus constituye siempre una emergencia  El desarrollo moderado o abundante de B. cereus en una herida se considera usualmente significativo según algunos autores (Barnham y col.)  Bacillus cereus es considerado el agente etiológico de una intoxicación alimentaria si se lo aisla simultáneamente del alimento (> 105 UFC/g) y de las heces o vómitos del paciente y la cepa es enterotoxina +

Conclusión Debemos estar alerta frente al aislamiento de un bacilo gram positivo aerobio, esporulado, inmóvil, no beta-hemolítico y lecitinasa positiva de muestras clínicas o ambientales