CROMATOGRAFÍA

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS GENERALIDADES Botánico ruso Mikhail Tsweet, en 1903 utilizó una columna rellena de carbonato de calcio para separar varios pigmentos vegetales. A.J.P. Martyn y R.L.M. Singer recibieron el premio Nobel en 1952 por sus descubrimientos en éste campo. El término CROMATOGRAFIA proviene del griego chroma, que significa “color”, y graphein, que significa “describir”. Es un método analítico empleado ampliamente en la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS GENERALIDADES El concepto se ha aplicado a una gran variedad de sistemas y técnicas, pero todos tienen en común el empleo de una fase estacionaria y una fase móvil. Los componentes de una mezcla son llevados a través de la fase estacionaria por el flujo de una fase móvil gaseosa o líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración entre los componentes de la muestra.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es fija o estacionaria y la otra móvil. La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de distribución de cada componente entre las dos fases. FE sólido líquido gel FM gas líquido fluido sc

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Elución Proceso por el cual la FM atraviesa la columna Eluyente columna eluato Velocidad de flujo (mL/min) volumen de disolvente que atraviesa la columna por minuto Velocidad de flujo lineal (cm/min) longitud de columna atravesada por el disolvente en un minuto Velocidad de FM Representa físicamente los espacios intersticiales entre las partículas empaquetadas en la columna que son accesibles a la FM, e incluye además los volúmenes internos del sistema Volumen muerto V0

Tiempo de retención relativo Información analítica relativa a la muestra Cromatograma funcionamiento del sistema cromatográfico Representación gráfica de la respuesta del detector en función del tiempo, volumen de eluyente o distancia en el lecho cromatográfico t0 Tiempo muerto intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es insertado al principio del lecho cromatográfico hasta que sale del mismo tR Tiempo de retención el tiempo que tarda el máximo de un pico en ser eluido después de la inyección Tiempo de retención relativo t’R t'R = tR - to diferencia entre el tiempo de retención del analito y el volumen muerto de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna comparado con un compuesto no retenido

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Fundamento del proceso cromatográfico Forma de realizar dicho proceso TIPOS DE CROMATOGRAFÍA TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS La naturaleza de las fases móvil y estacionaria y la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, es decir, el mecanismo de interacción. dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS CLASIFICACIÓN Los métodos cromatográficos son de dos tipos: * Cromatografía en columna * Cromatografía plana Cromatografía en columna. Donde la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase móvil es forzada a pasar a través del tubo bajo presión o por gravedad. Cromatografía plana. Donde la fase estacionaria esta sostenida por una placa plana o en los poros de un papel. En este caso, la fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por acción capilar o bajo la influencia de la gravedad.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS AFINIDAD

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS APLICACIONES Análisis cualitativo Análisis cuantitativo: * Análisis basado en la altura del pico * Análisis basado sobre el área del pico * Calibración con estándares * Método del estándar interno IMPORTANCIA DE LA CROMATOGRAFÍA Permite separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible realizar por otros medios

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS DATOS IMPORTANTES Las separaciones cromatográficas pueden clasificarse en cromatografía en columna y cromatografía planar, esta clasificación esta basada en la forma como las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto. Los métodos cromatográficos en columna se clasifican en cromatografía de líquidos y cromatografía de gases. De modo general las aplicaciones de la cromatografía están orientadas al Análisis Cualitativo y al Análisis Cuantitativo (basado en la altura del pico, áreas del pico, calibración y patrones, estándar interno, normalización de áreas).

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFIA PLANA Cromatografía en papel Cromatografía en capa delgada TLC (Thin Layer Chromatography) Cromatografía en capa delgada de alto rendimiento HPTLC (High performance Thin Layer Chromatography)

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA (TLC – HPTLC) PROCEDIMIENTO Elección de la fase estacionaria Elección de la fase móvil Acondicionamiento de la placa ¿Requiere activación? Aplicación de la muestra Acondicionamiento de la cámara de desarrollo Desarrollo del cromatograma Secado de la placa Visualización Interpretación de los resultados: Rf Cuantificación

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA (TLC) SOPORTE Vidrio, plástico o metal (20 x 20 cm) con o sin CaSO4 FASE ESTACIONARIA Sílica gel Kieselguhr (tierra de diatomeas) Alumina (Óxido de Aluminio) Celulosa y derivados Resinas de cambio Iónico Poliamidas (plásticos semicristalinos) Fase ligada FASE MÓVIL Uno o varios disolventes según la polaridad deseada

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS FACTORES QUE AFECTAN AL Rf FASE ESTACIONARIA Calidad y presencia de impurezas Presencia o ausencia de CaSO4 Naturaleza del cromatoplato, espesor, homogeneidad y preparación (extemporánea) Grado de activación en TLC de adsorción FASE MÓVIL Composición y naturaleza Grado de saturación de vapor en el tanque TEMPERATURA DIMENSIONES DEL TANQUE DISTANCIA DE DESARROLLO RELACIÓN MASA / SUPERFICIE EN LA PLACA

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

La placa se instala dentro de una cámara o cubeta con disolvente La muestra se diluye en un solvente volátil (0.01-0.1%) La muestra sube por capilaridad, arrastrando los componentes de la mezcla con él Se aplica la muestra de 1-2 cm del extremo de la placa usando un capilar Diámetro de la mancha de 5mm Cámara o cubeta

Separación Detección

Identificación

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