Detección de Estados Neoplásicos y Pre-Neoplásicos en Exámenes de rutina y Biología Molecular Francisco Gutiérrez C(1); Adolay Sobarzo E(1);Juan Luís Castillo N(2). ( 1) Alumno carrera de Tecnología Médica, Universidad de Concepción. (2) Tutor encargado del ramo Biología Molecular, Universidad de Concepción. 18/12/06

¿QUÉ ES EL CÁNCER?

Muerte celular Proliferación celular Desequilibrio

¿Qué es el cáncer? Neoplasia Maligna Clon celular Descontrol Ciclo celular TumorInfiltraciónMetástasis

Evolución Natural del Cáncer Tejido Normal Hiperplasia Metaplasia Anaplasia Displasia Neoplasia

Génesis del cáncer Mutaciones Acumuladas ?

CÁNCER ? 1.Continuidad de señales positivas de proliferación por activación de oncogenes. 2.Pérdida de señales negativas de crecimiento por inactivación de genes supresores. 3. Escape de la apoptosis por producción de factores de sobrevida IGF 4. Inmortalización atribuible a la activación de la telomerasa. 5. Angiogénesis sustentada por factores angiogénicos 6. Alteración de las moléculas de adhesión celular.

Genes Involucrados Oncogenes Oncogen ras Oncogen c-myc Oncogen c-fos

Supresores de Tumores Gen APC (poliposis adenomatosa coli) Gen DDC (deleted in cancer colorectal) Gen RB Genes Involucrados

Reparadores del ADN Gen TP53 Gen MSH-2 Gen MLH-1 Gen PMS-1 y PMS-2 Genes Involucrados

Génesis del cáncer Aneuploidía Mutaciones Acumuladas

“Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales” “Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, o simplemente una pequeña secuencia de ADN, alias aneuploidía” Proc Natl Acad Sci USA 94: (1997) Biochem J 340: (1999) Proc Natl Acad Sci USA 97: (2000) Cell Motil Cystoskel 47: (2000) Cell cycle 2: (2003) IUBMB life 56:65-81 (2004) Nature Biotechnol 21:13-14 (2003) GENES VII (Lewin B.) Teoría de Aneuploidía

¿Cuál es el origen de la aneuplodía? Ganancia o pérdida cromosómica durante la división celular: Espontánea Inducción química Mutat Res. 410:3-79 (1998) Biochem J. 340: (1999)

División normal V/S aneuploidía División NormalAneuploidía 49,9 50,1

Teoría de la Aneuploidía Aneuploidía al azar Estado de Aneuplodía Desestabiliza genes y cromosomas Reordenamientos y acortamientos cromosómicos Des balance en grupos de proteínas que segregan, sintetizan y reparan cromosomas Near diploid (2n) Baja inestabilidad Near Aneuploid Alta inestabilidad y adaptabilidad Muerte celular por aneuplodía: Nulisomías Acortamientos cromosómicos no viables Mutaciones letales Cell cycle 3: (2004) Near Triploid (3n)Near tetraploid (4n)

Aneuploidía Célula no cancerosa Bajo el límite para el cáncer Aneuploidía Célula cancerosa Cytometry 22: (1995) Biochem J. 340: (1999) Se alcanza o sobre pasa el límite para el cáncer (en forma gradual o abrupta)

Métodos de Detección Métodos morfológicos Proteínas ADN Biología Molecular Muestra de tejido o muestra de sangre del paciente Genómica Proteómica Patología Muestra de tejido del paciente Chip del gen

Detección por Morfología CitologíaHistologíaInmunoHístoquímica Tsissue Microarrays CITOLOGIA.jpg images/ot- mucinous%20adenocarcinoma.jpg www2.udec.cl/~webpatologia/fotos/ cancer2/pages/page_3.html ww.zeiss.com/C12567BE00472A5C/G raphikTitelIntern/TMA_Array/$File/TM A_array_357.jpg

Detección por Biología Molecular

Microarrays Chip de gen ADN ADNc fluorescente Microarreglo escaneado

Microarreglo escaneado No hace juegoEl rojo hace juego Célula normal Aislar a los ARNm s Añadir al microarreglo de ADN Producir ADNc s fluorescentes

Miocito El ADNc fluorescente del linfocito “ilumina” al gen de inmunoglobulina El ADNc fluorescente de la célula muscular “ilumina” al gen de miosina ADNc fluorescente ARNm de inmunoglobulina ARNm de miosina + transcriptasa inversa Microarreglo escaneado Microarreglo de ADN Inmunoglobulina Linfocito Miosina + transcriptasa inversa Microarreglo escaneado Microarreglo de ADN

Utilizando al ADN para Comparar Células Cancerosas con Células Normales Célula normal Microarreglo escaneado Añadir al microarreglo de ADN Producir ADNc s fluorescentes rojos y verdes Sólo los verdes hacen juego Sólo los rojos hacen juego Ambos, rojos y verdes hacen juego Ninguno hace juego Aislar los ARNm s Célula cancerosa

Interpretando los Datos El gen del cáncer se expresó 18 veces más que el gen normal Artwork by Jeanne Kelly. © 2002.

Citometría de Flujo Estudio de Ploidía de ADN mediante estudio del ciclo celular de lesiones pre-neoplasicas y neoplasicas

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica. Se obtiene una estimación de las fases del ciclo celular. Se obtienen resultados de la cantidad de ADN celular, lo que se traduce en discriminar poblaciones diploides y aneuploides. Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

2X 1X G1 SG2 MG1 FASES CICLO CELULAR CONTENIDO ADN CANTIDAD DE ADN V/S TIEMPO

PI Fluorescence DNA Análisis 2N 4N Purdue University Cytometry Laboratories

PI Fluorescence DNA Análisis Aneuploid peak DNA index 1.21 Purdue University Cytometry Laboratories

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN. ID: Razón de la Cantidad de ADN de la Muestra v/s el control. ID = Contenido ADN Células G0G1 Muestra Contenido ADN Células G0G1 Control Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR PLOIDIA ADN Diploide ADN Aneuploide ADN Hiperdiploide ADN Hipodiploide INDICE ADN = 1 > 1 < 1 INDICE ADN (ID): Medición de Ploidía de ADN

Proteómica Entendida como una genómica funcional Biomarcadores Pautas terapéuticas

Electroforesis Bidimensional Nuevos puntosPuntos perdidos

Protein Chip

Espectrometría de Masa

Discusión Faltan mas estudios comparativos entre ambas teorías, motivo por el cual se conoce poco de Aneuploidía. Todas las neoplasias presentan aneuploidía, en contraste con mutaciones acumuladas. Existen estudios que desprecian la teoría de la Aneuploidía como causa común en neoplasias de Adenocarcinoma esofágico(1). La aneuploidía es una consecuencia de inestabilidad genómica de las mutaciones acumuladas. (1)

Discusión Las técnicas de genómica, detectan los problemas a nivel de Ac. Nucleicos, lo que posibilita un diagnóstico oportuno y a la raíz misma de éste. Las técnicas proteómicas detectan el resultado de todo el proceso de expresión génica (inclusive los factores epigenéticos), siendo más efectivo y fácil de dilucidar.

Conclusión La displasia es un concepto en el que ni los propios morfologos están de acuerdo, por lo que las técnicas de biología molecular son la futura solución a este dilema. Los diagnósticos morfológicos se hacen cada vez más incompletos sin técnicas complementarias que determinen más certeramente el pronóstico de la neoplasia.

Conclusión Es importante poder identificar cual técnica es la mas ideal para poder diagnosticar una neoplasia en particular, considerando que en un futuro se harán tratamientos personalizados. A futuro, la detección de estados neoplásicos y pre- neoplásicos serán diagnósticados de forma predictiva en base a la proteómica y genómica, identificando tempránamente el cáncer.

Agradecimientos Profesor Juan Luís Castillo N. Dr. Marcelo Larremendi.