Importancia de la detección de variantes minoritarias de mutaciones de resistencia Federico García Unidad de Microbiología Molecular H. Universitario San Cecilio Granada

Variantes minoritarias Poblaciones minoritarias. Detección ultrasensible de mutaciones de resistencia. No se trata de detectar mutaciones en pacientes con baja carga viral. No confundir con detección ultrasensible de viremia.

Mutaciones de resistencia TAR VIRUS SALVAJE Resistente a AR Nueva infección Mutación primaria RESISTENCIA PRIMARIA

Mutaciones de resistencia TAR VIRUS SALVAJE Tiempo sin TAR Nueva infección Resistente a AR RESISTENCIA PRIMARIA

Persisten aquellas mutaciones con capacidad replicativa similar a los WT K103N V106A P236L Y181C Gerondelis et al. J Virol. 1999 vol.73:5803 Archer et al. J Virol. 2000 vol.74:8390

Secuenciación de ADN en pacientes con más de 1 año de infección WT K103N L74V K65R M184V >20% Secuenciación

Resistencia Primaria CoRAO Martin L et al (CoRAO). XII Reunión SEIMC

Clonación de productos de PCR: técnica de referencia >20% Secuenciación Tiempo sin TAR

Inconvenientes Muy Laboriosa Tardamos entre 2-5 días más. Elevado coste: 20-100 reacciones de secuenciación

Alternativas En el XV International HIVDR Workshop (Sitges, Junio 2006) se presentaron 15 comunicaciones en las que se describen las distintas plataformas disponibles para la detección de variantes minoritarias (Abst #33, 34, 43-45, 56, 66, 69, 70, 80, 96, 117, 152, 161, 169) En el V European Resistance Workshop (Cascais, Marzo 2007) hubo una sesión plenaria dedicada a la detección ultrasensible de mutaciones de resistencia, y 5 comunicaciones (Abst #20, 57-59, 78)

Plataformas disponibles PCR alelo específica a tiempo real Oligonucleotide ligation assay (OLA) LigAmp Secuenciación de genoma único Ultra-deep sequencing o 454 sequencing Multi-genome sequencing (MGS) MultiCode RTx PASS

PCR alelo-específica a tiempo real: flujo de trabajo aac aat K103K RT-PCR aac aat K103N AAC Asn (N) AAT Asn (N)

En Tiempo Real..... Detectamos variantes por debajo del 1%. Pero.... A veces un aminoácido lo codifican más de un codón R: ArgCgT, CgC, CgA, Cgg, AgA, ACg V: Val gTT, gTC, gTA, gTg N: Asn AAT, AAC Sólo podemos detectar una mutación por ensayo

Detección de mutaciones de resistencia RT-PCR Secuenciación Clonación PCR tiempo real Ventajas Procesividad Todas las mutaciones Detecta cualquier variante Detecta 0.1-2% Adaptable a Lab. Asistencial Inconven. No detecta <20% Laborioso/Tiempo para resultado/Coste Mutaciones puntuales

Interés clínico de la determinación de Variantes Minoritarias En Terapia de Inicio: para la correcta elección del acompañante de los NUCs (y de los NUCs). En Rescate: para mejorar la interpretación del genotipo de resistencia.

Variantes Minoritarias y Terapia de Inicio Análisis retrospectivo de 138 pacientes que participaron en ZODIAC Johnson J et al. XV Int HIVDRW. Sitges 2006.

Variantes Minoritarias y Terapia de Inicio K103N Y181C M184V Tiempo 11 POS 2 nunca <50 4 a 2 meses 2 a 4 meses 2 a 6 meses 19 25 31 41 44 47 63 65 67 Johnson J et al. XV Int HIVDRW. Sitges 2006.

Variantes Minoritarias y Terapia de Inicio Pacientes naïve < 18 meses de infección Variantes minoritarias en 18 pacientes más (9.9%): M184V n=16; K103N n=3; ninguna L90M. Relación con falta de respuesta sólo cuando se tienen en cuenta variantes mayoritarias. Peuchant O et al. CROI 2007. Abstract 666.

Variantes minoritarias: Seroconvertores 49 Acute seroconverters Metzner et al, AIDS 2005, 19:1819-1825

Variantes Minoritarias ¿en todos los pacientes naïve? Seroconvertores vs Nuevos diagnósticos o Naïve de larga evolución ¿de todas las mutaciones? WT WT K103N L74V M184V K65R

Rescatabilidad, Secuenciación 1er Fracaso M184V 1er Rescate FACIL Inicio IPr1,2 1er Fracaso M184V+K103N 1er Rescate FACIL, pero Inicio EFV3 M184V+L74V ó K65R K103N, K101E, V179D DIFICIL Inicio EFV 1. Ananworanich et al. 3rd IAS 2005. Poster WePe4.4C12; 2. Slim J, et al. 8th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, 12-16 November 2006, Oral and Poster PL2.5. 3. 3.- ZODIAC: Moyle G, et al. J Acquir Immune Defic Syndr 2005;38:417

Para evitar este fracaso 1er Fracaso M184V+L74V ó K65R K103N, K101E, V179D 1er Rescate DIFICIL Inicio EFV K103N L74V M184V K65R Investigar Resistencias Basales Investigar Variantes Minoritarias

Alternativas Actuales para Tratamientos una vez al día TDF ddI ABC 3TC FTC + NUCs Tercer brazo EFV ATV/RTV* FPV/RTV** SQV/RTV** * No aprobado en Europa para terapias de inicio ** No aprobado en Europa para administración QD Panel on Clinical Practices for Treatment of HIV Infection convened by the U.S.Department of Health and Human Services (DHHS). Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-Infected Adults and Adolescents - October 6, 2005. http://AIDSinfo.nih.gov .

Alternativas Actuales para Tratamientos una vez al día K65R L74V M184V + NUCs Tercer brazo K103N ATV/RTV* FPV/RTV** SQV/RTV** * No aprobado en Europa para terapias de inicio ** No aprobado en Europa para administración QD Panel on Clinical Practices for Treatment of HIV Infection convened by the U.S.Department of Health and Human Services (DHHS). Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-Infected Adults and Adolescents - October 6, 2005. http://AIDSinfo.nih.gov .

Nuestra Experiencia (CoRAO) 155 nuevos diagnósticos CoRAO 2/155 (1.3%) K103N 5/155 (3.3%) K103N Var. Minoritarias. Martin L et al (CoRAO). XII Reunión SEIMC

Variantes minoritarias y Rescate Descamps D, et al. IV European HIV Drug Resistance Workshop. Monte Carlo, 2006. Poster 64. K65R persistance. Moffatt A, et al. 45th ICAAC. Washington, 2005. Poster H-1067. K65R. Flys T, et al. J Infect Dis. 2005;192:24-29. Single dose NVP & K103N. Metzner KJ et al. JID 2003;188:1433-1443. M184V y STI. Roquebert B, et al. AIDS 2006; 20(2):287-9. PI & resistencia a NFV Lecossier D, et al. J Aquir Immune Defic Syndr. 2005;38:37-42. K103N en fracaso a NVP.

Main Findings K103N detected in 4 of 16 patients who failed nevirapine Clones expressing K103N for each pt: 1%, 5%, 33%, 76% No mutations detected in control samples 2 of 4 patients with K103N virus subsequently received efavirenz Both failed treatment K103N detectable by standard genotyping after second failure 5 of 12 patients who failed nevirapine but did not have K103N subsequently received efavirenz 4 failed efavirenz salvage therapy New NNRTI resistance mutations detected in all 4 patients Lecossier D, et al. J Aquir Immune Defic Syndr. 2005;38:37-42.

Key Conclusions Minority populations of HIV-1 expressing K103N undetected by standard genotyping prevalent in patients failing nevirapine therapy Patients with K103N virus failed salvage therapy with efavirenz K103N emergence also detected in patients prematurely discontinuing nevirapine New strategies accounting for the contribution of minority variants on drug resistance necessary More sensitive viral detection methods should be developed Lecossier D, et al. J Aquir Immune Defic Syndr. 2005;38:37-42.

Variantes Minoritarias y Rescate

Variantes Minoritarias, Ya disponemos de algunas plataformas para su detección Aunque existen preguntas por contestar, cada vez existen más datos a favor de la utilidad de su detección para la correcta selección de los ARVs en la terapia de inicio Para el rescate, la detección ultrasensible de mutaciones de resistencia supondrá una mejora en los criterios de interpretación del genotipo

Necesidades Una plataforma que permita detectar variantes minoritarias, con la máxima sensibilidad y precisión y, además, que permita detectar varias mutaciones en un solo ensayo

Agradecimientos Miembros de CoRAO (Almería, Granada y Jaén) Personal de la Unidad de Microbiología Molecular del HU San Cecilio B. Hernández y C. Gutiérrez, Ramón y Cajal.