Métodos para contar células Hemocitómetro Basados en la microscopía Tinción de cultivos en monocapa Medidores de la resistencia Métodos para contar células Electrónicos Análisis de imagen Citómetro de flujo Peso Métodos aproximados Contenido de ADN Contenido de proteínas Métodos para contar células

El hemocitómetro o cámara de Neubauer

La cuadrícula del hemocitómetro 1 mm Profundidad = 0,1 mm (rojo) (verde) (gris) (amarillo) (azul) La cuadrícula del hemocitómetro

Se introduce la suspensión de células en el hemocitómetro

La región de recuento del hemocitómetro

La cámara de recuento del hemocitómetro

Recuento de células con el hemocitómetro

Observación con microscopio óptico y recuento de células

Diferencias entre células vivas y muertas De las tres líneas, la del centro es la que corresponde al límite del cuadrado Célula muerta Célula viva Diferencias entre células vivas y muertas

Tinción de cultivos en monocapa

Hay tres tipos de contadores electrónicos

Funcionamiento del contador de células electrónico (1)

Funcionamiento del contador de células electrónico (2)

Hay que establecer el rango de tamaños a medir Es importante poner límites a los tamaños (diámetro celular) que se van a medir. El límite inferior elimina el ruido electrónico y los residuos celulares. El límite superior se pone en 30 micras o en infinito. 7,6 – 50 mm Hay que establecer el rango de tamaños a medir

El contador distingue las células muertas

Con este contador no hay que marcar las células

Recuento mediante análisis de imagen

Fundamento del recuento de células por análisis de imagen

Recuento de células por análisis de imagen

Esquema del análisis de la imagen

Recuento de células mediante citometría de flujo

La difracción de luz frontal permite contar las células y, a la vez, nos da información sobre su tamaño. Citometría de flujo

Estimación del número de células a partir del peso

Estimación del número de células a partir contenido proteico

Método de Bradford: fundamento

Método de Bradford: protocolo

Estimación del número de células a partir contenido de ADN

Determinación de ADN por la fluorescencia del H33258

Estimación del ADN por la absorbancia en el ultravioleta

Comparación de los diversos métodos para contar células

Métodos para determinar la viabilidad de las células Exclusión del azul tripán Marcaje fluorescente con naranja de acridina y ioduro de propidio Métodos para determinar la viabilidad de las células Síntesis de novo de proteínas Incorporación de 3H-timidina al ADN Métodos para determinar la viabilidad de las células

Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán

Viabilidad celular mediante tinción con azul tripán

Células vivas Células muertas Naranja de acridina: atraviesa la membrana celular y tiñe los ácidos nucleicos, generando una intensa fluorescencia de color verde a bajas concentraciones. Ioduro de propidio: no atraviesa la membrana de células intactas, pero sí la de las células dañadas. Se une a los ácidos nucleicos, desplazando al naranja de acridina y genera una intensa fluorescencia de color rojo. Células muertas Viabilidad celular: Naranja de acridina + Ioduro de propidio

Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de proteínas

Medida de la viabilidad celular a partir de la síntesis de ADN