Tema 16 INHIBICIÓN ENZIMÁTICA II 1. Inhibición pseudoirreversibles 2. Inhibición irreversible 2.1 Inhibidores irreversibles o venenos catalíticos 2.2 Análisis de la velocidad de inactivación enzimática 2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible 1.-Inhibición irreversible simple. 2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato. 3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente 4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.

1. Inhibición Pseudoirreversible Inhibidores [I] no es >>> [E] Inhiben a concentraciones parecidas a la enzima Ki <<<<< Ki de Inhibidores reversibles Orden 10-12 a 10-14 Unión fuerte a los enzimas Pseudoirreversible el equilibrio está completamente desplazado hacia la formación del complejo [EI] [EI] no es despreciable E +I EI Io= I + EI Eo=E + EI a razón de velocidades máximas en presencia y ausencia de inhibidor

EI = Eo – E EI = Eo – aEo EI = Eo (1-a) Io= I + EI Eo=E + EI Dividiendo los dos miembros por (1-a)

m=Ki Eo 1/a a valores experimentales

Inhibidor titula a la enzima Representación de Willian y Morrison: Inhibición pseudoirreversible Io=0 vo Io=1,5nM Io=3,0 nM Io=4,5nM 1,5 3,0 4,5 Eo nM Inhibidor titula a la enzima

2. Inhibidores irreversibles 2.1 Venenos Catalíticos Inhibidor irreversible une a la enzima por un proceso irreversible* (constante de disociación 10-9 mol l-1) Inhibidores se unen por enlaces covalentes a centro activo de la enzima Inhibición suele ser progresiva. Depende del tiempo * Los inhibidores irreversibles o venenos catalíticos son sustancias que se unen a la enzima de manera tal que reducen su actividad prácticamente a cero. - Esto es de particular importancia en los procesos de purificación de enzimas: * Muchas enzimas son “envenenadas” por trazas de metales pesados, y por esta razón, es una práctica común utilizar sustancias complejantes, p. ej., EDTA, en los tampones de ensayo, para secuestrar estos metales pesados.

Prostaglandin-H-Sintasa aspirina Prostaglandin-H-Sintasa

-La aspirina inhibe la formación de Protaglandina-G2, gracias a la metilación de la subunidad o dominio responsable de la actividad ciclooxigenasa, de la Prostaglandina-H-sintetasa.

Penicilina

La enzima modificada por la penicilina no puede unir el puente de poli-Gly

2.2. Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible E +I EI* Se forma este complejo que es inactivo Cinética [I]>>>[E] El I esta en exceso no cambia durante la inhibición [I] =[Io] La cinética de la inhibición irreversible puede ser modelada usando un modelo de primer orden de la forma [EI]* mM [EI]*=[ET] (1-exp-k`T) K`(s-1) tendrá un significado diferente dependiendo del mecanismo exacto de inhibición Tiempo (s)

2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible 1.-Inhibición irreversible simple. E + I EI* 2.-Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato. E + S ES 3.- IInhibición irreversible simple tiempo dependiente E + I EI EI* 4.- Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato. E + I EI EI*

1.-Inhibición irreversible simple. ki E + I EI* Reacción de segundo orden ki constante de inhibición de segundo orden (M-1 s-1) Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI I =Io Ecuación diferencial de primer orden describe el cambio en la concentración de [EI] en el tiempo k`=ki [Io]

Integración de la ecuación [EI]* mM k`=ki [Io] Calcula k` Tiempo (s) Se obtiene una constante de inhibición de segundo orden

Substrato puede proteger a la enzima de la inhibición irreversible 2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato. ki E + I EI* E + S ES Substrato puede proteger a la enzima de la inhibición irreversible Ks Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI* I = Io Sustituyendo y despejando

ki Integración de la ecuación Calcula k` k`(s-1) [EI]* mM Calcula k` Tiempo (s) k`(s-1) Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor m S y Ks constantes se pueden calcular idenpendientemente ki Io mM

3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente E + I EI EI* Ki ki Rápido equilibrio reversible entre E y el I seguida de una reacción lenta e irreversible de inactivación [EI]* Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*

Integración de la ecuación Calcula k` [EI]* mM Calcula k` k`(s-1) Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor Hipérbola rectangular Ki y ki Procedimientos de regresión no linear Io mM

4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato. Ki ki E + I EI EI* E + S ES Ks Sustituyendo y despejando

Integración de la ecuación Calcula k` [EI]* mM Calcula k` k`(s-1) Graficando k` frente a diferentes concentraciones de Inhibidor Hipérbola rectangular Ki y ki Procedimientos de regresión no linear Io mM

Como distinguirías entre una Inhibición irreversible tiempo dependiente y otra Inhibición irreversible tiempo independiente k`(s-1) k`(s-1) Io mM Io mM

RESUMEN ● Existen unos inhibidores denominados pseudoirreversibles que no cumplen todas las condiciones de Michaelis, puesto que la concentración inicial de inhibidor [Io] es efectiva al mismo orden de magnitud que la concentración inicial de enzima. En este tipo de inhibición la Ki presenta valores que van desde 10-8 -10-12. Se comportan como inhibidores pseudoirreversibles la gran mayoria de inhidores de naturaleza proteica, así como los anticuerpos obtenidos frente a las proteínas enzimáticas. El comportamiento cinético es diferente de los inhibidores reversibles. ● Los inhibidores suicidas son compuestos que son inactivos como inhibidores en ausencia de enzimas, se activan específicamente por la enzima a la que van a inhibir , uniéndose covalentemente a la proteína enzimática. ● Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible. Muestra un comportamiento dependiente de la presencia de substrato y de la posibilidad que el parámetro tiempo influya en el proceso de unión covalente. Así se distinguen desde el punto de vista cinético: Inhibición irreversible simple Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato. Inhibición irreversible simple tiempo dependiente Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato