Inmunorreacciones rápidas activadas magnéticamente mediante microesferas magnéticas fluorescentes funcionalizadas: Un estudio de viabilidad S. Sakamoto, K. Omagari, Y. Kita, Y. Mochizuki, Y. Naito, S. Kawata, S. Matsuda, O. Itano, H. Jinno, H. Takeuchi, Y. Yamaguchi, Y. Kitagawa y H. Handa Abril de 2014 www.clinchem.org/content/60/4/610.full © Copyright 2014 by the American Association for Clinical Chemistry

Antecedentes Durante las últimas 2 décadas, se ha propuesto una gran cantidad de nuevos métodos de diagnóstico en la documentación académica aunque pocos han llegado al usuario final. Un obstáculo es que para que llegue a afianzarse un nuevo método de diagnóstico, deben considerarse ampliamente las diferentes facetas de la tecnología, que incluyen la manipulación de muestras, la química de los análisis y los equipos físicos de dispositivos, desde el principio para que puedan funcionar en forma conjunta sin problemas en la implementación final. Por ejemplo, para desarrollar una prueba más rápida, los reactivos bioquímicos por sí solos no son suficientes; en cambio, estos también deben trabajar con equipo de fácil acceso para los usuarios finales. Consulte Editorial por Sia SK. On the Path from Materials Chemistry to Clinical Use. (En la vía de la química de los materiales al uso clínico). Clinical Chemistry 2014; 60: 573-574.

Introducción Los inmunoanálisis se usan comúnmente en la medición de biomarcadores en las áreas clínicas y de investigación. Si bien habitualmente se utiliza el análisis ELISA, este es un enfoque demandante y relativamente complejo. La inmunorreacción que utiliza partículas magnéticas ha atraído la atención como una forma de mejorar la eficiencia de los análisis. Los informes de inmunoanálisis con partículas magnéticas han involucrado principalmente la separación con asistencia magnética de las partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos del medio de contraste para facilitar los procedimientos del análisis.

Preguntas ¿Es posible construir un sistema de inmunorreacción rápido y confiable con partículas magnéticas funcionalizadas? ¿Es posible utilizar la fuerza magnética para la aceleración de una inmunorreacción? ¿Es posible detectar una inmunorreacción sin el uso de enzimas?

Materiales y métodos Microesferas de ferrita fluorescente (microesferas de FF) Dispersión Obtención magnética Luz visible Ultravioleta -Copolímero de estireno y GMA -PoliGMA -Complejo de europio -Nanopartícula de ferrita Pueden dispersarse de forma adecuada Pueden obtenerse magnéticamente Demuestran una alta fluorescencia

Pregunta Las microesferas de FF son sustancias funcionales que presentan una doble función (sólida fuerza magnética y alta intensidad de fluorescencia). ¿Pueden usarse las microesferas de FF en forma eficaz para obtener una inmunorreacción rápida?

Materiales y métodos Anticuerpo de captura – Antígeno - 1 a 3 min - Microesferas de FF – Imán - 1 a 2 min -Excitación Emisión Inmunoanálisis con obtención magnética de microesferas de FF Inmunohistoquímica con obtención magnética de microesferas de FF Microesferas de FF - 10 min – Imán - 1 a 2 min Excitación - Emisión

Resultados A B Cifras de fluorescencia (cps) Tiempo de incubación (min) A B Figura 1. Detección de BNP mediante inmunoanálisis no competitivo con microesferas de FF recubiertas de anticuerpos anti-BNP. Resultados de la detección de BNP con imán (A) y sin imán (B). Las líneas roja, azul, verde y anaranjada representan 200, 20, 2.0 y 0 pg/ml de BNP, respectivamente.

Resultados C D E Cifras de fluorescencia (cps) Concentración (pg/ml) Figura 1. Detección de BNP mediante inmunoanálisis no competitivo con microesferas de FF recubiertas de anticuerpos anti-BNP. Resultados de detección de BNP a un único tiempo de incubación: 1 min (C); 2 min (D); 3 min (E). Los marcadores azul y rojo representan la detección de BNP con y sin imanes, respectivamente. Todos los datos están expresados como media (SD) de 3 mediciones.

Resultados A B Cifras de fluorescencia (cps) Tiempo de incubación (min) Resultados A B Figura 2. Detección de PSA mediante inmunoanálisis no competitivo con microesferas de FF recubiertas de anticuerpos anti-PSA. Resultados de la detección de PSA con imán (A) y sin imán (B). Las líneas roja, azul, verde, roja discontinua, azul discontinua, verde discontinua y anaranjada representan 6.3, 2.0, 0.64, 0.20, 0.064, 0.020 y 0 ng/ml de PSA, respectivamente.

Resultados Cifras de fluorescencia (cps) Concentración (pg/ml) Figura 2. Detección de PSA mediante inmunoanálisis no competitivo con microesferas de FF recubiertas de anticuerpos anti-PSA. Resultados de la detección de PSA a un único tiempo de incubación: 1 min (C), 3 min (D), 10 min (E), 30 min (F). Los marcadores azul y rojo representan la detección de PSA con y sin imanes, respectivamente. Todos los datos están expresados como medias (SD) de 3 mediciones.

Resultados Concentración de PSA medida por el inmunoanálisis no competitivo con microesferas de FF (ng/ml) Concentración de PSA medida por el inmunoanálisis convencional (CLEIA) (ng/ml) Figura 3. Comparación de concentraciones de PSA medidas por el inmunoanálisis convencional (CLEIA) y por el inmunoanálisis no competitivo con microesferas de FF. Todos los datos están expresados como medias (SD) de 3 mediciones.

Resultados A B C Figura 4. Tinción inmunohistoquímica de las células A431 (células de cáncer epidermoidal humano, nivel de expresión de EGFR alto) (A); células H69 (células de carcinoma microcítico de pulmón, bajo nivel de expresión de EGFR) (B) y muestras de la biopsia con aguja gruesa de cáncer de mama mediante el uso de microesferas de FF recubiertas de anticuerpos anti-EGFR (C). Izquierda, tinción de HE; medio, tinción incluida en parafina; derecha, tinción inmunohistoquímica con obtención magnética de microesferas de FF.

Resultados Resultados de la tinción inmunohistoquímica Resultados del inmunoanálisis no competitivo La obtención magnética de microesferas de FF en el paso de la inmunorreacción permitió la detección de marcadores de la enfermedad dentro de los 5 min posteriores a la adición de la muestra. Resultados de la tinción inmunohistoquímica Una obtención magnética de 10 min de microesferas de FF en el paso de incubación permitió la discriminación ultra rápida y confiable de células de carcinoma.

Pegunta para el análisis ¿Por qué la obtención magnética de microesferas de FF posibilita un inmunoanálisis rápido y una inmunohistoquímica rápida?

Análisis Los resultados indican claramente que la fuerza magnética mejora y acelera las interacciones específicas entre antígenos y anticuerpos, y la aplicación de la obtención magnética de microesferas de FF en un espacio particular para la inmunorreacción puede mejorar de forma radical el tiempo total de análisis y la cantidad de pasos necesarios. La detección rápida y analíticamente sensible exitosa de las moléculas objetivo mediante la obtención magnética de microesferas de FF en los pasos de la inmunorreacción puede explicarse por la concentración magnética de los antígenos y anticuerpos en forma local en la placa o las muestras, seguida de la medición fluorescente directa sin la necesidad de la amplificación de señales.

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