TECNICAS MOLECULARES Francisca Burgos V 08-11

Inmunoensayos Conjunto de técnicas inmunoquímicas analíticas de laboratorio. Complejos inmunes = conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito (sustancia objeto de análisis) determinado, que puede ser el anticuerpo (Ac) o un antígeno (Ag). Medir molécula como marcador que hace parte de la reacción con el complejo inmune en la prueba o ensayo químico.

Inmunoensayos Gran especificidad y afinidad de los anticuerpos por sus antígenos específicos. Usan los anticuerpos monoclonales (obtenidos en el laboratorio, más específicos ) o de sueros policlonales (obtenidos de animales). Gran sensibilidad y especificidad permite la cuantificación de compuestos presentes en líquidos orgánicos en concentración reducida (nanogramos/ml o de picogramos/ml). El desarrollo del inmunoensayo ha tenido gran impacto en el campo del diagnostico médico mediante pruebas de laboratorio o química clínica.

Usos de Inmunoensayos Medición de niveles de hormonas: por ejemplo la medición de niveles de hormonas tiroideas o de estrógenos Medición de metabolitos en suero cuya cantidad o presencia son indicios de daño celular: Por ejemplo la medición de marcadores biológicos miocárdicos como las troponinas Detección de virus: por ejemplo de los causantes de hepatitis y su individualización Detección del cáncer o de células tumorales: a través de sus proteínas o marcadores tumorales, liberados en el suero de los pacientes. Detectar exposición a agentes infecciosos: por ejemplo de rubéola o toxoplasmosis en mujeres embarazadas o en personas inmunosuprimidas. Detección de metabolitos indicadores de problemas fisiológicos, por su presencia o cantidad excesiva, en la sangre : por ejemplo en caso de anemia se mide niveles de ferritina. Medir niveles de medicamentos, drogas objeto de abuso y toxinas en sangre.

Tipos de inmunoensayos Por la técnica de medición Competitivo: Antígeno (Ag) objeto de la medición compite con un antígeno marcado por un anticuerpo (Ac). Mide la cantidad del antígeno marcado sin conjugar que se considera es inversamente proporcional al analito.

Por la técnica de medición No competitivo (tipo sándwich): el Ag de la muestra reacciona con dos Ac diferentes que se fijan a distintas partes del Ag . Uno de los Ac generalmente está en soporte sólido para facilitar la separación de la fracción ligada, y el otro Ac lleva la marca. Se mide por la cantidad del marcador considerando que es directamente proporcional a la cantidad del analito.

1. Método Directo: Reacción inmune del Ag con Acs conjugados con enzima Unión de un Ac primario, conjugado con una enzima , con la consiguiente formación del Ac primario conjugado que se une al Ag, visualizándose la reacción Ag- Ac, Método Directo: Unión de un anticuerpo primario (2) conjugado con una enzima (3), con la consiguiente formación del anticuerpo primario conjugado, que se une al antígeno (1).                                                        

2. Método indirecto de dos pasos En este método existen dos anticuerpos: El Ac primario unido al Ag, que se revela a través de un Ac secundario previamente conjugado con una enzima (anti- Ig), con la consiguiente formación del Ac secundario conjugado que se une al Ac primario, visualizándose la reacción anti- Ig. Tiene una gran capacidad de detectabilidad, pero la desventaja principal radica en el número incrementado de pasos de incubación y el gran número de controles requeridos Figura 2 Método Indirecto de dos pasos: El anticuerpo primario (2) unido al antígeno (1) se revela a través de un anticuerpo secundario (3), previamente conjugado con la enzima (4).

3. Método indirecto de tres pasos Consiste en un Ac terciario conjugado que reacciona con un Ac secundario conjugado previamente, unido al Ac primario. Figura 3 Método Indirecto de tres pasos: Anticuerpo terceario (5) conjugado con una enzima (6), reacciona con un anticuerpo secundario (3) conjugado con otra enzima (4), previamente unido al anticuerpo primario (2).

Tipos de Inmunoensayos Por el medio donde se realiza la medición Homogéneo: Señal generada por la unión del antígeno y el anticuerpo se mide directamente en el mismo medio que se utiliza para favorecer la formación del complejo inmune. Heterogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del antígeno y el anticuerpo se mide en un medio diferente que el utilizado para la unión del complejo inmune, generalmente implican una etapa intermedia de lavado para eliminar interferencias. Se considera que los inmunoensayos con formato homogéneo no competitivo son los más sensibles y específicos.

Tipos de Inmunoensayos Por el marcador Radioinmunoensayo (RIA) : el marcador es un isótopo radioactivo. Enzimoinmunoanálsis (EIA): el marcador es una enzima como por ejemplo la técnica de enzimoinmunoensayo conocido por su abreviatura ELISA. Fluoroinmunoanálisis: el marcador es una molécula fluorescente, por ejemplo FPIA. Ensayo Inmunoquimioluminiscente: la marca es en general una enzima capaz de catalizar una reacción quimioluminiscente. Son tanto o mas sensibles que los radioinmunoensayos, y no presentan riesgos de manipulación de sustancias radioactivas. En contraposición estan poco desarrollados y no siempre es posible aplicarlos.

DOT BLOT TIPO ELISA Se basa en la reacción antígeno-anticuerpo Es de tipo cualitativo Se emplea un anticuerpo que reconoce específicamente un determinado antígeno (ej., una cepa bacteriana) Luego un segundo anticuerpo (usualmente conjugado ej., una enzima) es añadido a la reacción para el reconocimiento del primer anticuerpo. Finalmente el sustrato es adicionado para que reaccione con la enzima y de cómo resultado una reacción visible.

DOT BLOT TIPO ELISA Simplificación de los métodos northern blot, Southern blot, ó Western blot. Biomoléculas para ser detectados no son separadas por cromatografía. Una gota que contiene la molécula se aplica directamente sobre una membrana. Detección por sondas de nucleótidos (northern blot y southern blot) ó anticuerpos (para un western blot).

DOT BLOT TIPO ELISA Ahorro de tiempo. Confirma la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. No ofrece información sobre el tamaño de la biomolécula blanco. Si dos moléculas de diferentes tamaños son detectadas, se seguirá viendo como un solo punto. Una muestra radiactiva puede ser hibridizada para permitir al investigador detectar la variación entre muestras.

Southern Blot Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern. Detecta la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los fragmentos de ADN y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.

Northern blot Northern blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja. Someter a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Transferencia del contenido del gel, a una membrana cargada positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.

Aplicaciones del Northern blot Permite observar un patrón particular de expresión genética entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas. Mostrar sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes supresores tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales. La variación en el tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o errores en el proceso de transcripción. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar que región del RNA ha sido delecionada

Ventajas y desventajas del Northern blot Detecta pequeños cambios en la expresión de genes que los microarrays no pueden identificar. Desventaja: Degradación de la muestra por RNAsas (endógenas de la muestra o a través de contaminación ambiental) Puede ser evitada por una apropiada esterilización de los materiales asó como el uso de inhibidores de RNAsas como el dietilpirocarbonato.

Western blot Inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular/cantidad relativa). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Transferencias a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia.

Colony blot Plaque OR Colony Blotting Techniques – Se utiliza para identificar las colonias de bacterias contiene el ADN de interés entre los miles de personas. Colonias bacterianas son transferidas a nitrocelulosa o membrana de nylon con recubrimiento. Debido a la carga negativa de la superficie celular, algunas células se unen a la membrana de nitrocelulosa. Membrana se coloca en una solución de NaOH 0,5 N para romper la superficie de la célula, convertir DNA de doble cadena en ADN de cadena simple y unirse al ADN a la membrana. Posteriormente, la membrana se transfiere a una solución que contiene solución de proteasa después de neutralizar con una solución de neutralización.

Colony blot Observar: Una colonia donde el ADN da hibridación positiva. La ventaja de este método es que se pueden hacer varias copias idénticas de ADN a partir de una placa maestra.

ELISA Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay Procedimiento de inmunodetección cualitativo y cuantitativo Se aplica en el diagnóstico de enfermedades y en investigación (estudios inmunológicos, endocrinológicos, expresión de proteínas) Basado en el uso de anticuerpos mono o policlonales, los cuales pueden reconocer al antígeno de interés en una mezcla no purificada de antígenos. El proceso de determinación involucra el uso de una serie de anticuerpos los cuales forman un complejo de antígenos-anticuerpo/anticuerpo-enzima/sustrato

Inmunohistoquímica Procedimiento histopatológico basado en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno, aplicado a una muestra de tejido orgánico, correctamente fijada e incluida en parafina. Detección de antígenos sobre cortes histológicos mediante anticuerpos mono o policlonales. Con la utilización de alguna de las técnicas específicas (peroxidasa antiperoxidasa, fluoresceína, etc.), el complejo antígeno - anticuerpo así formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citológicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antigénicos característicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular y se determina el tipo de célula involucrado en la muestra.

Inmunohistoquímica 1.- Antígeno de PSA (prostatic specific antígeno o antígeno prostático especifico) es expresado en las células prostáticas. Entonces, para detectar el antígeno del PSA se crea un anticuerpo anti-PSA. 2.- c-kit (CD117), es un factor de transcripción celular. Este antígeno es expresado en tumores conocidos como GISTs (gastrointestinal stromal tumors o tumores stromales gastrointestinales).

Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP) El DNA genómico extraído de células se digiere con enzimas de restricción selectiva. Digeridos se someten a una electroforesis en gel de agarosa, el DNA se desnaturaliza en tiras de una sola cadena y el patrón de los fragmentos se transfiere a una membrana de soporte, mediante Southern blot. Los fragmentos de DNA, se hibridan con una sonda específica para el sitio x, marcado con material radioactivo drb1 y aparecen como patrones de bandas aisladas de tamaño específico (kB). Si los cebadores hibridizan con la muestra de DNA, es visible una banda (la cual indica la presencia del alelo x particular). Falta de amplificación implica la ausencia de esa secuencia alélica particular en la muestra de DNA.

Primers de secuencia específica (SSP) DNA de la muestra (células, tejidos) + Mezclar cebadores (especificidad para las secuencias características de cada uno de los alelos del sitio x que se desea tipificar). Colocar alícuotas de la muestra en tubos separados cada uno contiene un conjunto de cebador específico y se amplifica en un termociclador.

Los productos amplificados son objeto de electroforésis y se tiñen con bromuro de etidio y se fotografía bajo luz UV. Si hibridizan con la muestra de DNA, se hace visible una banda (la cual indica la presencia del alelo x particular). La falta de amplificación implica la ausencia de esa secuencia alélica particular en la muestra de DNA.

Sondas de oligonucleótidos especificas de secuencias (SSOP) Las sondas de oligonucleótido son segmentos cortos de DNA de tira simple, de 18 a 24 nucleótidos. Cada uno constituido por una secuencia de nucleótido complementaria a un motivo de secuencia particular que se encuentra dentro de las regiones invariables de los alelos x individuales.

Estas sondas solo hibridan con sus secuencias exactamente complementarias en condiciones estrictas de hibridación. Aún la diferencia de un simple par de bases hace que las sondas se separen del pareado con el DNA blanco. Está propiedad de especificidad perfecta de secuencia brinda a este modelo de tipificación una mayor resolución de alelos x buscados.

Tipificación basada en secuencia (SBT) DNA de una célula o tejido + amplificar mediante la PCR con el uso de cebadores de sitio o específicos a grupo. El producto amplificado se distribuye en cuatro tubos, cada uno de los cuales tiene polimerasa, dNTP y mezclas de establecimiento de secuencia . Cada una de estas mezclas esta marcada con un terminador de secuencia marcado con fluorescencia.

El tubo 1 contiene citosina marcada;el tubo 2, guanina marcada; el tubo 3, timina marcada y el tubo 4, adenina marcada. El producto se amplifica mediante la PCR para incorporar los terminadores marcados. Los cuatro tubos de muestra se mezclan y se sujetan a electroforésis para formar una escalera de secuencia, la cual se rastrea por un láser para generar un electroferograma de secuencia del DNA.

Con el uso de programas de computadora se compara la secuencia con la biblioteca de secuencias de antígenos x y se asignan los antígenos x

Tipificación VNTR El genoma humano contiene trechos de secuencias sumamente repetitivas, que a menudo se presentan en agrupamientos. El numero de repeticiones en un agrupamiento varia entre individuos y da lugar a un número variable de duplicados colocados en tándem (VNTR).

Este polimorfismo puede traducirse en fragmentos de amplitud variable para amplificación con la PCR mediante primers diseñados para amplificar la región de la repetición. Los VNTR tienen clásicamente una longitud de 10 a 50 bases, también se usan polimorfismos genéticos de secuencias cortas conocidas como duplicados cortos en hilera (STR) de 4 a 9 pb de longitud, para la determinación de “huellas digitales” de DNA.

Los VNTR pueden analizarse con electroforesis del DNA ya sea genómico o amplificado por la PCR. Una aplicación de los VNTR es la vigilancia del establecimiento del injerto en receptores de transplante de médula ósea. Los análisis de VNTR se usan como un marcador genético con aplicaciones tanto clínicas como forenses.

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa. Reacción de extención de partidores (cebadores, primers) utilizada para amplificar ácidos nucleicos. Un pequeño fragmento de ADN (< 3000pb) es amplificado millones de veces Permite determinar tamaño, secuencia de nucleotidos, etc Técnica muy utilizada en Biología de poblaciones. Permite trabajar con pequeñas cantidades de ADN Permite trabajar con muestras de museo muy antiguas

Consideraciones generales Temperatura de anillamiento: directamente relacionada con el contenido de G-C, A-T. La temperatura de PCR depende de la longitud y composición de los partidores. T-A = x 2 G-C = x 3 Longitud del primer: debe ser lo suficientemente complejo para que la prob de anillamiento con otra secuencia sea baja. Se recomienda que un primer tenga como mínimo 17 bases de longitud. Primers deben tener una longitud de 17-28b Contenido G-C debe ser de alrededor del 50-60% Se recomiendan Tms entre 50-75°C Evitar 3 o más C o Gs en la región terminal 3’ Terminaciones 3’ no deben ser complementarias para evitar la formación de dímeros Los primers no deben formar secuencias autocomplementarias para evitar la formación de estructuras secundarias.

Fragmento es purificado y enviado a secuenciar PCR Partidores LCO1490: 5’ –GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG –3’ HCO2198: 5’ –TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA –3’ (Folmer et al., 1994) Además: MgCl2 10x PCR Buffer DNTP’s H20 Taq pol ADN (20ng) 800 pb Fragmento es purificado y enviado a secuenciar Gel de agarosa (1%) teñido con Et-Br

Secuenciación Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger Frederick Sanger Fragmento de ADN abundante (clonación o PCR) Polimerasa ADN Primer Cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Cuatro didesoxi-nucleótidos (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Didesoxi-nucleotidos son nucleótidos modificados que terminan la elongación.

Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger

Método Automático de Secuenciación

Variabilidad de la secuencia de ADN Hebra original ATTCGCTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG Sustitución ATTCGTTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG ATTCGCTATCGAA- - -TACGCTGCGAACGGG Deleción ATTCGCTATCGAACGCCGCTACGCTGCGAACGGG Repetición ATTCG - - - CGAACGCTACGCTGCTATCGAACGGG Transposición

RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA) Especímen A Especímen B Polimorfismo de secuencia en el sitio del partidor Marcador dominante (presencia ausencia) Utiliza partidores universales al azar (10pb) Permite amplificar fragmentos entre 200-2000pb Permite amplificar varios loci al mismo tiempo

Utilidad: - Cartografía genética - Hibridación - Estructura genética de poblaciones 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 Matriz de datos es llevada a al programa TFPGA

Ventajas Desventajas Fácil y barato Aproximación multilocus No requiere el diseño de partidores específicos Permite analizar un gran número de loci a nivel genómico Su variabilidad es neutra a los efectos de la selección natural Desventajas Reducción de la diversidad alélica (sólo 2 alelos) Es un marcador dominante, no se pueden detectar heterocigotos Alto nivel de Homoplasia Dos bandas de igual tamaño pueden tener distintas secuencias Ausencia de banda puede ser producto de una o varias mutaciones Exhibe graves problemas de reproducibilidad y poco comparables En muchos casos son imprecisos Técnicas y analíticas

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ADN Técnica popular que permite detectar una gran cantidad de marcadores de ADN polimórficos rápidamente. Involucra una digestión con enzimas de restricción y dos rondas de PCR Permite detectar presencia-ausencia de fragmentos de restricción. 1) Digestion con enzimas de restricción (EcoRI, MseI) C G T A A C C G C A T T G G C A A T T C C G T T A A G G 2) Ligación de adaptadores AATTC G T AAT TTAA Adaptador EcoR I TA Adaptador Mse I

Fuentes de polimorfismo: Pérdida de sitios de restricción In-dels AATTCN GN NT NAAT TTAA TA Primer 1 5’ --------- + A EcoR I C --------- 5’ Primer Mse I 3) PCR preselectivo Fragmentos de ADN con adaptadores Genera fragmentos de ADN entre 100-1500pb 4) PCR selectivo con partidores fluorescentes Primer 3 5’ --------- + AAC AATTCA GTTA CAAT TTAAGT AAC --------- 5’ Primer Mse I AATTCAAAC GTTGTTA AACCAAT TTAAGTTTG Corrida electroforética en gel de poliacrilamida bajo condiciones denaturantes Fuentes de polimorfismo: Pérdida de sitios de restricción In-dels

Ventajas Desventajas: Más eficiente que RAPD No requiere el diseño de partidores específicos Permite el análisis de un alto número de loci en el genoma Desventajas: Diversidad alélica por locus reducida sólo a presencia ausencia. Marcador dominante no permite detectar heterocigotos Requiere de ADN de alta calidad y pureza

Microsatelites Secuencias simples repetidas en tandem a nivel del ADN sin función conocida extremadamente variables También conocidos como SSR (Simple Sequence Repeats) SSR Mononucleotídica (A)11 ctgttgAAAAAAAAAAAtgagag SSR Dinucleotídica (GT)6 ccaagtGTGTGTGTGTGTtgaat SSR Trinucleotídica (CTG)4 cagagtCTGCTGCTGCTGgtaat SSR Tetranucleotídica (ACTC)4 actgtACTCACTCACTCACTCtgaat

Los microsatelites son considerados como: - DNA “basura” Homocigotos: …CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7 Heterocigotos: …CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7 …CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)9 Los microsatelites son considerados como: - DNA “basura” - Fuente necesaria de diversidad genética - Reguladores de la expresión y función de proteínas

Microsatelites (SSR) Dirección de la electroforesis Secuencia de microsatelite (CA)5 Alelo A Especímen A Especímen B Secuencia de microsatelite (CA)3 Alelo B Dirección de la electroforesis

Aplicaciones Análisis forenses Diagnóstico e identificación de enfermedades Estudios demográficos Estudios de estructura poblacional Estudios en genética de la conservación Determinación de stocks

Ventajas Desventajas Marcador codominante Uso relativamente simple En general son “neutros” al efecto de la selección natural Alta presición en la determinación de alelos Altamente variables Muchos alelos por locus (polimórficos) Desventajas Requieren diseño de partidores especie-específicos (500.000 c/u) Requieren de un secuenciador para el análisis de fragmentos Dinámica evolutiva desconocida Bandas stutter y alelos nulos complican su análisis Exhiben significativos niveles de Homoplasia

Microarrays

Debido a: 1) Aumento en la secuenciación genómica de distintas especies 2) Incremento en el conocimiento del funcionamiento de los genes Aparece una nueva técnica que analiza genes funcionales, Microarrays (microarreglos) Permite estimar el nivel de expresión de de cientos de genes en una muestra

Microarray: Porta-objeto con una matriz de cientos de puntos Cada punto tiene secuencias de ADN el cual codifica para un gen específico

Aplicación Mejor diagnóstico (ej. cancer) y terapias Genes implicados en la especiación Diferencia en la expresión de genes en poblaciones diferentes Estudio de comunidades bacterianas, microalgas, larvas planctónicas

Desventajas Actualmente es extremadamente cara ($ 50.000 la placa) Se requiere diseñar el banco de genes: tiempo y tecnología Por diferencias “entre-muestras”, siempre es necesario poner dos muestras juntas en una placa.

Usos potenciales de los distintos tipos de marcadores en ecología, filogeografia y filogenia Nivel Jerarquico Identidad genética Parentezco Poblaciones coespecíficas Especies relacionadas Niveles taxonómicos intermedios Separaciones profundas Electroforesis Secuencia Secuenciación DNA fingerprint de proteinas DNA/RNA mtDNA, scnDNA, intrones, RAPD, AFLP Adecuado, altamente informativo Marginalmente informativo Tomado de Sunnucks, 2000 TREE No apropiado