Solubilidad Es un balance entre atracciones Atracciones disolvente-disolvente Atracciones soluto-soluto Atracciones disolvente-soluto Habrá disolución sólo si 3 es mayor que 1 y que 2

Solubilidad de proteínas y separaciones por precipitación Solubilidad de proteínas en fuerza iónica baja Precipitación a fuerza iónica alta Precipitación con disolventes orgánicos Precipitación con polímeros Precipitación por afinidad Precipitación por desnaturalización selectiva pH disolventes orgánicos temperatura Scopes, R. K. Protein purification (1994)

Precipitación a fuerza iónica baja “Salting in” La solubilidad de las proteínas es resultado de interacciones polares con el disolvente, interacciones iónicas con las sales presentes y fuerzas electrostáticas repulsivas entre moléculas con cargas del mismo signo. + Repulsión Atracción Poca atracción/repulsión en el P.I. entre agregados heterogéneos + - + - + -

Precipitación a fuerza iónica baja “Salting in” Este comportamiento es útil en experimentos de diálisis y debe considerarse durante la filtración en gel La precipitación isoeléctrica se puede modificar agregando sales que afecten el pH isoeléctrico

Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out” El fenómeno de precipitación a fuerza iónica alta depende principalmente de la hidrofobicidad de la proteína Se puede entender como un equilibrio de competencia entre la sal y la proteína por el agua de solvatación

Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out” La solvatación de una región hidrofóbica es un fenómeno demandante desde el punto de vista entrópico

Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”

Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out” ¿Por qué (NH4)2SO4? Puntos a considerar Efectividad de la precipitación Interacción directa con la proteína Influencia del pH en la distribución de especies Solubilidad de la sal DHºdis Densidad de la disolución concentrada Precio

Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out” Serie liotrópica o serie de Hofmeister SCN– < ClO4– < NO3– < Br– < Cl– < acetato < SO42– < PO43– NH4+ > K+ > Na+ ¿Por qué? Hofmeister, F. (1888) Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 24, 247-260.

Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out” ¿Cuánto pongo?

Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out” Log S = A - m[(NH4)2SO4]

Precipitación por disolventes ¿Qué disolventes? ¿Qué hacen los disolventes? ¿Se desnaturalizan las proteínas?

Precipitación por disolventes ¿Cuánto disolvente?

Precipitación por disolventes ¿Desnaturalización, la puedo usar?

Precipitación por afinidad Agregado lineal formado por un anticuerpo policlonal y una proteína monomérica Agregado lineal formado por un anticuerpo y una proteína dimérica Agregado tridimensional formado por anticuerpos y una proteína tetramérica

Precipitación por desnaturalización selectiva

Precipitación por desnaturalización selectiva Con temperatura