MANIPULACIÓN GENÉTICA DE ORGANISMOS SUPERIORES TEMA 41 MANIPULACIÓN GENÉTICA DE ORGANISMOS SUPERIORES TRANSGENIZACIÓN

CONTEXTUALIZACIÓN Técnica que engloba un gran número de disciplinas y áreas de investigación: biología molecular bioquímica biología celular virología medicina… Hace disminuir el número necesario de animales de experimentación Tecnología de máxima actualidad y controversia Proporciona modelos extrapolables válidos de patologías humanas

INTRODUCCIÓN Un organismo transgénico es aquel que porta en su genoma genes “nuevos” En animales se consigue normalmente por microinyección de DNA purificado en el pronúcleo de huevos fertilizados En plantas, el DNA exógeno se transfiere desde la bacteria A.tumefaciens Se requiere la integración en el genoma del organismo manipulado

DATOS HISTÓRICOS 1891. El grupo de Heape describe los primeros éxitos de transferencia de embriones 1977. Gurdon transfiere mRNA y DNA en huevos de Xenopus y estudian la síntesis proteica 1981. Gordon y Ruddle acuñan la palabra transgénico: variante animal originada tras la introducción de genes nuevo en su genoma 1986. Brinster y Palmiter describen la introducción de genes dentro de la línea germinal de animales

LEGISLACIÓN EN ESPAÑA Legislación sobre Organismos Modificados Genéticamente. Real Decreto 951/1997 que establece el régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente, con el fin de prevenir el riesgo para la salud humana y el medio ambiente (B.O.E. 150, 24 de junio de 1997).

APLICACIONES DE LA TRANSGENIZACIÓN Bases genéticas de enfermedades y diseños de terapia Modelos para investigación de infecciones y terapia génica Modelos como banco de pruebas de diferentes drogas y medicamentos Diseños biotecnológicos en industrias agropecuarias Modelos de animales para analizar los efectos de la modulación, activación o supresión de la expresión génica

ASPECTOS A CONSIDERAR EN LA TRANSGENIZACIÓN Impacto medioambiental Aceptación pública Consideraciones éticas Legislación Seguridad en el caso de alimentos transgénicos Aspectos de patente, economía y uniformidad del producto

REFLEXIONES... ¿Podrían aparecer nuevas enfermedades o producirse un salto interespecífico de alguna enfermedad concreta? ¿Podrían crearse organismos altamente patógenos artificialmente? ¿Cuál sería el verdadero impacto medioambiental de algunos productos transgénicos si se liberaran en la naturaleza?.

PRODUCCIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOS 1º Determinar, caracterizar y purificar el material genético a transferir 2º Superovulación 3º Transferencia génica 4º Transferencia de embriones 5º Caracterización de la progenie

PREPARACION Y PURIFICACION DEL DNA DNA sin nicks o roturas de secuencia Tampones de microinyección de baja fuerza iónica Concentraciones de DNA entre 1 y 2 ng/ml. DNA con extremos no romos se integran mejor Microinyección en el pronúcleo masculino

PROCESOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR FRECUENTES Construcción de librerías génicas PCR Secuenciación nucleotídica Inserción en vectores Extracción, purificación y concentración

SUPEROVULACIÓN Mediante las siguientes hormonas: 1ª: - PMSG (Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin) - FSH (Follicle-Stimulating Hormone) 2ª: - HCG (Human Chorionic Gonadotropin) - LH (Luteinizing Hormone) Hasta 35 óvulos por hembra

MODELOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA Microinyección Infección viral (retrovirus normalmente) Transfección de células Embrionarias (ES) Segmento T-DNA del plásmido Ti (plantas)

MICROINYECCIÓN Transgén introducido directamente en el pronúcleo masculino (mayor tamaño) El tamaño del fragmento a microinyectar no es muy relevante, incluso Cromosomas artificiales de levadura (Yeast Artificial Chromosomes, YAC) Inserción en el genoma al azar

ELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓN Embriones en estadio 1 (2 pronúcleos) DNA a transferir purificado Microscopio de microinyección Micropipeta de sujección Pipeta de microinyección

REIMPLANTACION DE LOS EMBRIONES MICROINYECTADOS Transferencia al oviducto de una hembra pseudopreñada. Para ello, Cruce con ratones vasectomizados Los embriones se pueden congelar con un agente crioprotector (DMSO)

ANÁLISIS DE LA PROGENIE Técnicas de Biología Molecular: Southern blot Slot o Dot blot Northern blot PCR... Técnicas Inmunobioquímicas Inmunoprecipitación Inmunohistoquímica Inmofluorescencia Western blot... Otras: Desarrollo del animal Conducta...

CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) I Suelen derivar de la masa interna del blastocisto Pueden originar “en cultivos” células de diferentes tejidos (epiteliales, musculares…) ES reinyectadas en el blastocisto constituirán parte del tejido adulto

CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) II Permite recombinación homóloga del transgén con el genoma celular: Introducir un gen nuevo Sustituir uno ya existente por otro mutado, consiguiendo la pérdida funcional de dicho gen: “Knock-out” Las ES manipuladas se introducen en el útero de la hembra pseudopreñada Suelen producir Quimeras

TRANSFERENCIA GÉNICA EN “ES” Transfección: Precipitación con fosfato cálcico Lipofección Electroporación Infecciones virales: Retrovirus Adenovirus Herpesvirus

TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR RETROVIRUS Retrovirus alcanza una eficiencia de transferencia próxima al 100% Uno de los retrovirus más utilizados es el de la leucemia murina (MuLV). Embriones de 4-16 células pueden ser infectados con retrovirus recombinante Tras la infección, el embrión se reimplanta en el útero de la hembra pseudopreñada El virus solo puede integrar, al azar, una copia de DNA por célula.

RESUMEN DE LA TRANSFERENCIA GÉNICA

TRANSGENIZACIÓN POR CÉLULAS ES Transfección Colonias ES Cultivos ES Quimeras

Algunos ejemplos de transgénicos