Teórico Práctico Lunes 04.03.13 Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real RT-qPCR

Modelo Experimental

Resultado Esperado… Sangre Hígado

DIA 0 DIA 1 AA1 AA2 AA3 AA4 C1 C2 C3 C4 100 ul Sangre + 1 mL TriPure 10 mg Hígado + 1 mL TriPure + Homog -80°C

DIA 2 Extracción de ARN Lisis 1) TriPure (TriZol) Isotiocianato de Guanidina Fenol Lisis Desnaturalización de proteínas Conservación de ácidos nucleicos Separación de fases Lisis Desnaturalización de proteínas Conservación de ácidos nucleicos Membranas de sílica (unión al ARN) 2) PureLink RNA Minikit Isotiocianato de Guanidina Columnas de purificación

Método rápido Mínima contaminación con ADN Alto rendimiento de purificación de ARN ARN de alta calidad y pureza

ARN obtenido… Cuantificación (A260) Estimación de la pureza (A260/280) Chequeo de la integridad (Gel Agarosa 1.5%)

DIA 3 Tratamiento con DNasa No “estrictamente” necesario si se diseñan primers que hibriden en la unión intrón-exón Control del tratamiento con DNasa Sin retrotranscriptasa

Moloney Murine Leukemia Virus Síntesis de cDNA Mix I Oligo-dT dNTP Mix Oligos Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) Mix II Buffer DTT RNase OUT Mix III Buffer DTT H20 SLO – miR-122 SLO – miR-16 SLO – miR-Let7a 5S RT 18S RT The SuperScript III enzyme is a version of MMLV reverse transcriptase that has reduced RNaseH activity, a longer half-life (220 minutes) and is more thermostable, resulting in increased specificity and higher yields.

DIA 4 Real Time PCR miR-122 miR-16 miR-Let7a 18S 5S Control negativo (No template control, NTC) Control positivo FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (ROCHE) SYBR Select Master Mix (APPLIED BIOSYSTEM)

ROX: reactivo fluorescente pasivo Normaliza diferentes fuentes de variabilidad entre wells Errores de pipeteo Limitaciones del instrumental (óptica del sistema) FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (ROCHE) SYBR Select Master Mix (APPLIED BIOSYSTEM) Heat-labile Uracil-DNA Glycosylase (UDG) dNTP blend containing dUTP/dTTP Treatment with heat-labile UDG can prevent the reamplification of carryover PCR products by removing any uracil incorporated into single- or double-stranded amplicons (Longo et al., 1990).

DIA 5 Análisis de resultados Curvas de amplificación y de melting Threshold, línea de base NTC: contaminación o dímeros de primer? Control positivo Desviación estándar de las réplicas técnicas Desviación estándar de las réplicas de RT Control de la Normalización Procesamiento analítico de los Cq Análisis Estadístico