BACTERIAS ANAEROBIAS INTRODUCCIÓN AL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO BIOQ. MIRTA LITTERIO mirtalitterio@yahoo.com.ar MICROBIOLOGIA HOSPITAL J.P.GARRAHAN SUBCOMISIÓN DE BACTERIAS ANAEROBIAS-SADEBAC-AAM

Diagnóstico microbiológico: PRE- aislamiento Introducción. Anaerobiosis Diagnóstico microbiológico: PRE- aislamiento Características orientadoras en el huésped Muestra: toma y transporte Medios de cultivo y Sistemas de incubación Diagnóstico microbiológico presuntivo a GENERO: POST- aislamiento Características orientadoras en la muestra Prueba de tolerancia al oxígeno y coloración de GRAM Patrones de sensibilidad a discos de antibióticos (con carga especial) Diagnóstico microbiológico a ESPECIE: POST- aislamiento Pruebas de uso frecuente en el laboratorio Implicancia clínica Microbiota normal Factores predisponentes del húesped Infecciones Clostridium difficile Factores de riesgo para el desarrollo de diarrea asociada a C difficile (DACD) Rango de enfermedad entérica Cepas toxigénicas Metodos de diagnóstico de diarrea asociada a C.difficile Tratamiento y Medidas de prevención

ATMÓSFERAS SU COMPOSICIÓN

++++ +++ V + ++ AEROBIO ANAEROBIO 80% ATMÓSFERA MICROORGANISMO 60% 40% 20% 0% MICROORGANISMO AEROBIO OBLIGADO ++++ +++ V µ-AEROFILO ANAEROBIO FACULTATIVO AEROTOLERANTE + ++ µ-AEROTOLERANTE

PRUEBA DE TOLERANCIA AL O2 JARRA ANAEROBIA AGAR SANGRE ANAEROBIO AEROBIO….??? ANAEROBIO ….??? PRUEBA DE TOLERANCIA AL O2

CARACTERÍSTICAS ORIENTADORAS DE LA PRESENCIA DE ANAEROBIOS FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED TRAUMA MALA IRRIGACIÓN, HIPOXIA DAÑO TISULAR, NECROSIS, TEJIDO DESVITALIZADO MUCOSA DAÑADA MECANISMOS DE DEFENSA AUSENTES (P/E: REFLEJOS DE DEGLUCIÓN) ENFERMEDAD DE BASE (P/E: DIABETES)

TOMA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS X ANAEROBIOS CONDICIONADOS POR INTOLERANCIA AL O2 MICROBIOTA HABITUAL

MICROBIOTA NORMAL Propionibacterium acnes PIEL CAVIDAD ORAL Y TRS Propionibacterium acnes Peptoniphilus asaccharolyticus Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella, Fusobaterium nucleatum – Cocos gram-positivos, Actinomyces 100:1 (ANA/AER) TRACTO GENITAL FEMENINO COLON Bacilos gram-negativos: Bacteroides grupo fragilis– Cocos gram-positivos - Clostridium, Eubacterium, Bifidobacterium 1000:1 (ANA/AER) Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella bivia-disiens, Cocoss gram-positivos Lactobacillus - Clostridium

TOMA DE MUESTRAS PUNCION ASPIRACION CIRUGIA EVITANDO “FLORA INDIGENA”

TOMA DE MUESTRAS Decontaminación previa de la zona con alcohol 70% Aplicación de tintura de yodo (30 segundos) o solución acuosa de yodo (un minuto) Remoción de la preparación de yodo con alcohol 70%

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS MODALIDAD EVITANDO AIREACIÓN TIEMPO DE SOBREVIDA LÍQUIDAS VOLUMENES PEQUEÑOS VIAL DE TRANSPORTE (TAB) RASPADOS HISOPADOS TEJIDOS PEQUEÑOS TUBOS MEDIO STUART CARY-BLAIR PRE-REDUCIDO 8-24 HS A TEMPERATURA AMBIENTE TEJIDOS GRANDES TUBO SECO ESTERIL EN BOLSA DE PLASTICO CON GENERADOR DE ANEROBIOSIS

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS AIREADAS TIEMPO DE SOBREVIDA MUESTRA !! LÍQUIDAS < 1 ml = 1 ml > 2 ml < 10 min = 30 min > 2-3 hs !! TEJIDOS PEQUEÑOS <1 cm3 ≤ 30min TEJIDOS GRANDES >1 cm3 2-3 hs TEMPERATURA AMBIENTE

SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS MEDIOS SOLIDOS NO SELECTIVOS AGAR SANGRE ANAEROBIO (ASA) Agar base (Columbia,TSA,BHI, etc) suplementado: sangre lacada, vitamina K, hemina, CO3H-, extracto de levadura, tween 80, piruvato, etc. SELECTIVOS y/o DIFERENCIALES FEA, BBE, KVLB, EYA, etc

SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS MEDIOS LÍQUIDOS CALDO CEREBRO CORAZÓN CALDO TIOGLICOLATO suplementado: vitamina K, hemina, CO3H-, extracto de levadura, tween 80, piruvato, etc SELLAR VASELINA-PARAFINA (3/2) SIN SELLAR COLUMNAS ALTAS

INCUBACIÓN EN ANAEROBIOSIS JARRA PLACAS OXYRASA JARRA GENERADORES DE ANAEROBIOSIS BOLSAS CÁMARA

PROCESAMIENTO INICIAL MUESTRA AGAR SANGRE ANAEROBIO (ASA) COLORACIÓN DE GRAM BOLSAS JARRA ANAEROBIA CALDO ANAEROBIO INCUBAR 48 HS 37ºC

CARACTERÍSTICAS ORIENTADORAS DE LA PRESENCIA DE ANAEROBIOS MUESTRA--MACROSCÓPICAS COLOR OLOR PRESENCIA DE GRANOS MUESTRA—MICROSCÓPICAS—COLORACIÓN DE GRAM Ef ASOCIACIÓN FUSO ESPIRILAR HEMOCULTIVO BG(+) “ARAÑITAS” GANGRENA BG(+) RECTANGULARES

EXAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS PLACAS DE SIEMBRA PRIMARIA CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS del CULTIVO OLOR PIGMENTO (NEGRO-MARRÓN) FORMA Y ASPECTO DE LAS COLONIAS ASA PIGMENTO NEGRO ASA BBE/ASA

PRUEBA DE TOLERANCIA al O2 ESTRIAR (37ºC) 24-48 HS DE INCUBACIÓN RESULTADOS 2 ACH 2 1 1 1 3 3 2 AE/ANA FAC 5 3 5 4 4 4 ACH 5 2 2 1 ASA PLACA CON SIEMBRA PRIMARIA ASA 3 1 5 ANAEROBIO 3 4 5 ASA 4 POR LO MENOS 2 VECES

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 2 ASA GRAM DE COLONIA 1 3 ANAEROBIO 5 4 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE COLONIAS BORDES PIGMENTO (NEGRO/MARRÓN) CONSISTENCIA (SECA/MUCOSA)

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 2 ASA ASA 1 3 ANAEROBIO 5 0.5 MF 4 V 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% SPS 5% MTZ DISCOS GRAM BGN CGN BGPNE BGPE CGP RS V S R

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO GRAM NEGATIVOS BACTEROIDES GRUPO FRAGILIS BACTEROIDES GRUPO UREALYTICUS FUSOBACTERIUM SPP PORPHYROMONAS SPP PREVOTELLA SPP OTROS BACTEROIDES OTRAS PREVOTELLA VEILLONELLA SPP BACILOS COCOS

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Bacteroides grupo fragilis R BACILOS GRAM (-) B fragilis B distasonis B ovatus B thetaiotaomicron B eggerthii B stercoris B caccae B merdae B uniformis B vulgatus B splanchnicus NUEVAS spp.* B goldsteinii B nordii B salyersiae

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Porphyromonas spp. S R Prevotella spp. RS BACILOS GRAM (-) pigmentados PIGMENTO NEGRO / MARRÓN FLUORESCENCIA ROJA UV 365

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Bacteroides grupo ureolyticus like R S BACILOS GRAM (-) B. ureolyticus Campylobacter gracilis C rectus Bilophila wadsworthia Suterella wadsworthensis

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Fusobacterium spp. R S BACILOS GRAM (-) F nucleatum F necrophorum F varium F mortiferum F ulcerans

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Prevotella spp. NO PIGMENTADAS R RS S Bacteroides spp. BACILOS GRAM (-) P buccae P oris P heparinolytica P zoogleoformans P dentalis P oralis group P enoeca P bivia P disiens

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO 5µ K 1000µ Co 10µ B 20% Veillonella spp. R S Acidaminococcus fermentans Megasphera elsdenii COCOS GRAM (-) PENICILINA 10 µg

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO GRAM POSITIVOS BACILOS 1 ESPORULADOS CLOSTRIDIOS 2 NO ESPORULADOS LACTOBACILOS, EUBACTERIUM, ACTINOMYCES, PROPIONIBACTERIUM COCOS PEPTOSTREPTOCOCOS, PEPTOCOCOS FINEGOLDIA SP., MICROMONA SP.

O2 IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO BACILOS GRAM (+) 5µ Co 10µ MTZ O2 BG(+)ESPORULADO= CLOSTRIDIOS S R SR BG(+)NO ESPORULADO BACILOS GRAM (+) C perfringens C difficile C septicum C sordelli C botulinum C tetani C butyricum C tertium C histolyticum Actinomyces spp. Bifidobacterium spp. Eubacterium spp. Eggerthella sp. Filifactor spp. Lactobacillus sp. Mobiluncus spp. Propionibacterium spp. Rothia sp. AEROTOLERANTES A

O2 IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO COCOS GRAM (+) COCOS G (+) V 5µ Co 10µ SPS 5% MTZ O2 COCOS G (+) S R RS COCOS GRAM (+) Peptostreptococcus anaerobius Micromonas micros Peptococcus niger Finegoldia magna Anaerococcus spp. Peptoniphilus spp. Gallicola spp. SPS = S

Yuli Song et al.;JCM Vol45 N2.2007 IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO V 5µ Co 10µ SPS 5% MTZ O2 COCOS G (+) S R RS COCOS GRAM (+) Peptostreptococcus anaerobius P.stomatis P.micros Peptococcus niger Finegoldia magna Anaerococcus spp. Grupo I Grupo III SPS = S Yuli Song et al.;JCM Vol45 N2.2007

Tabla 1- Identificación de Anaerobios: patrones de discos de potencia especial Microorganismo Vc Kn Co Bi SPS MTZ Gram-negativos R1 V Bacteroides grupo fragilis R Prevotella spp. R/S S/R S Porphyromonas spp. Fusobacterium spp.2 Bacteroides grupo ureolyticus3 Veillonella spp. Gram-positivos S4 Cocos gram-positivos R5 Clostridium spp. 1- Porphyromonas spp. son Vc S. 2- Nitrato negativo, 3- incluye Campylobacter spp. 4- Algunas cepas de lactobacilos y la mayoría de Clostridium innocuum son R a Vc (5µg). 5- Peptostreptococcus anaerobius y algunas cepas de Micromonas micros son S. Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Bacteriology Manual, 6th edition. 2002

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE ESPECIE

METODOS CONVENCIONALES-PRUEBAS IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE ESPECIE METODOS CONVENCIONALES-PRUEBAS REQUERIMIENTO DE FORMATO/FUMARATO COAGULACIÓN / DIGESTIÓN DE LECHE CRECIMIENTO CON BILIS AL 20% FERMENTACIÓN DE AZÚCARES REDUCCIÓN DE NITRATOS FLUORESCENCIA CAMP REVERSA MOVILIDAD PYR PRODUCCIÓN DE INDOL LIPASA LECITINASA CATALASA DESULFOVIRIDINA FOSFATASA ALCALINA ARGININA DIHIDROLASA L-PROLINA AMINOPEPTIDASA HIDRÓLISIS DE UREA ESCULINA GELATINA

MICROBIOTA NORMAL COLONIZACIÓN DEL RECIÉN NACIDO CAVIDAD ORAL TRACTO INTESTINAL TRACTO GENITAL

FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED GENERALES DIABETES CORTICOSTEROIDES ENFERMEDADES MALIGNAS COLAGENOPATIAS DROGAS CITOTÓXICAS INMUNOSUPRESIÓN ESPLENECTOMÍA NEUTROPENIA HIPOGAMAGLOBULINEMIA MECANISMOS DE DEFENSA ALTERADOS (P/E REFLEJOS DE DEGLUCIÓN) LOCALES BAJO POTENCIAL REDOX INSUFICIENCIA VASCULAR ANOXIA TISULAR DESTRUCCIÓN TISULAR CUERPO EXTRAÑO

INFECCIONES ASOCIADAS ENDÓGENAS RELACIONADAS A MUCOSAS RELACIONADAS A LA MICROBIOTA NORMAL POLIMICROBIANAS EXÓGENAS CLOSTRIDIALES NO CLOSTRIDIALES

INFECCIONES ASOCIADAS SISTEMA NERVIOSO CENTRAL ABSCESO INTRACRANEANO (EMPIEMA SUBDURAL) (ABSCESO CEREBRAL) ABSCESO EPIDURAL INFECCIONES EN PACIENTES CON SHUNT VENTRICULO-PERITONEAL

INFECCIONES ASOCIADAS CAVIDAD ORAL MUCOSITIS GINGIVITIS PERIODONTITIS

INFECCIONES ASOCIADAS TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR OTITIS MEDIA CRÓNICA COLESTEATOMA MASTOIDITIS CRÓNICA SINUSITIS CRÓNICA

INFECCIONES ASOCIADAS TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR NEUMONÍA ASPIRATIVA ABSCESO PULMONAR EMPIEMA PLEURAL

INFECCIONES ASOCIADAS ABDOMEN PERITONITIS ABSCESOS INTRAABDOMINALES ENTEROCOLITIS NECROTIZANTE COLANGITIS

INFECCIONES ASOCIADAS TRACTO URINARIO ABSCESO PERINEFRÍTICO ABSCESO INTRARRENAL

INFECCIONES ASOCIADAS PIEL Y PARTES BLANDAS ABSCESO CUTÁNEO ONFALITIS ULCERAS DE DECÚBITO ABSCESO PILONIDAL MORDEDURAS

INFECCIONES ASOCIADAS HERIDAS Y TEJIDO NECRÓTICO CELULITIS FASCITIS GANGRENA IMPÉTIGO COMPARTIMIENTOS DE LA PIEL EPIDERMIS DERMIS CELULAR SUBCUTANEO FASCIA MUSCULAR ERISIPELA CELULITIS FASCITIS FOLÍCULO PILOSO FOLICULITIS

INFECCIONES ASOCIADAS HUESO-ARTICULACIONES ARTRITIS CRÓNICA OSTEOMIELITIS CRÓNICA SECUNDARIAS A TRAUMATISMOS EXTERNOS APARATO GINECOLÓGICO SALPINGITIS ENDOMETRITIS INFECCIÓN PELVIANA ABORTO SÉPTICO VAGINOSIS BACTERIANA SEPSIS-BACTERIEMIAS FOCO ABDOMINAL

DIARREA ASOCIADA A C difficile CAUSA MAS FRECUENTE DE DIARREA NOSOCOMIAL EN PAISES DESARROLLADOS PREVALENCIA 10-17% HÁBITAT NATURAL: MEDIO AMBIENTE, SUELO, HECES. PORTACIÓN: NEONATOS 50% 2 AÑOS < 4% AMBULATORIO-SANO 3-4% HOSPITALIZADO 1-2 SEM 20% 4 SEM 50%

DIARREA ASOCIADA A C difficile SIGNOS Y SINTOMAS ASINTOMÁTICA DIARREA (LEVE A SEVERA) COLITIS COLITIS PSEUDOMEMBRANOSA MEGACÓLON TÓXICO PERFORACIÓN INTESTINAL MUERTE

DIARREA ASOCIADA A C difficile

DIARREA ASOCIADA A C difficile

DIARREA ASOCIADA A C difficile

FACTORES DE RIESGO DACD DIARREA ASOCIADA A C difficile FACTORES DE RIESGO DACD ANTIBIOTICOS PREVIOS ANTINEOPLASICOS ENF DE BASE SEVERA INTUBACIÓN NASOGÁSTRICA INH. DE LA BOMBA DE PROTONES EDAD ≥ 65 AÑOS HOSPITALIZACION PROLONGADA PAC QUIRÚRGICOS > PAC. MÉDICOS

DIARREA ASOCIADA A C difficile CEPA TOXIGÉNICA NO TOXIGÉNICA A= ENTEROTOXINA tcdA B= CITOTOXINA tcdB A + B + A – B + A – B – S I DACD NO DACD

DIARREA ASOCIADA A C difficile CEPA PREVALENCIA TOXIGÉNICA 0.2 % USA 3% UK 12.5% JAPÓN 24.1% ARGENTINA 31% POLONIA A – B + S I DACD

CEPA epidemica USA / EUROPA - NAP1 DIARREA ASOCIADA A C difficile 2002 CEPA epidemica USA / EUROPA - NAP1 A= ENTEROTOXINA X 16 B= CITOTOXINA X 23 Deleción 18pb en el gen tcdC, gen regulador negativo de los genes de la tox Ay B CDT=TOXINA BINARIA actin-specific ADP-ribosyltransferasa ¿¿¿¿¿¿Asociada a mayor virulencia ????? R a gatifloxacina R a moxifloxacina

DIARREA ASOCIADA A C difficile Ejemplo de diferentes denominaciones de Cd según tecnica empleada para su caracterización C difficile características TECNICA PCR*** Ribotipo Toxinotipo PFGE** REA* A+ B+ CDT+ Casos fatales Canada 027 III NAP 1 BI A- B+ 017 VIII CF Hallado en alimentos humanos y animales V BK Brotes hospitalarios en USA + Clinda O J *REA Analisis x endonucleasas de restricción (grupos: BI,J,K,G,Y,CF,BK) **PFGE Electroforesis en gel de campo pulsado ***PCR Reacción en cadena de la polimerasa EPIDEMICA

DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DIARREA ASOCIADA A C difficile DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE LABORATORIO DETECCIÓN DE LAS TOXINAS A Y/O B DIRECTAMENTE EN MATERIA FECAL. DE CEPA AISLADA DE C DIFFICILE POR CULTIVO

DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DIARREA ASOCIADA A C difficile DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE LABORATORIO DETECCIÓN DE LAS TOXINAS A Y/O B MATERIA FECAL: FRESCA. CONSERVACION: HASTA 2 DÍAS 4ºC ≥72 HS -20 / -70ºC ( INACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA DE TOXINA )

DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PRODUCTO DETECTADO TIEMPO CORRELACIÓN CLÍNICA Cultivo celular Toxina B 24-48 hs. Máxima sensibilidad Buena especificidad Aglutinación con Látex Glutamato (GDH) deshidrogenasa 30 min. Baja sensibilidad Baja especificidad EIE Toxina A A-B+ Toxinas A y B 2-4 Regular sensibilidad Buena especificidad Inmunoblot Toxina A A-B+ En estudio PCR Gen toxina B Buena sensibilidad Regular especificidad

DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS CULTIVO EN LINEA CELULAR = METODO PATRÓN ENSAYO DE CITOTOXICIDAD POSITIVO EFECTO CITOPÁTICO (-) EFECTO CITOPÁTICO (+) MATERIA FECAL o Clostridium difficile TOXINA B (+) EXTRACTO + ANTITOXINA EXTRACTO CULTIVO CELULAR FIBROBLASTOS

MUESTRA PARA CULTIVO BACTERIOLÓGICO DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS MUESTRA PARA CULTIVO BACTERIOLÓGICO MATERIA FECAL ETANOL CCFA + SANGRE C difficile recuperado 30 MIN /T AMB. ANAEROBIOSIS 24-48HS SHOCK ETANÓLICO DETECCIÓN DE TOXINA

DIARREA ASOCIADA A C difficile TRATAMIENTO DACD 1- PACIENTES COLONIZADOS NO PROFILAXIS

TRATAMIENTO DACD DIARREA ASOCIADA A C difficile 2- PACIENTES INFECTADOS: DISCONTINUAR TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO

DIARREA ASOCIADA A C difficile TRATAMIENTO DACD 2- PACIENTES INFECTADOS: ENFERMEDAD LEVE S/SINTOMAS SISTÉMICOS DIARREA LEVE MTZ-4X(250mgVO)X10d MTZ-3X(500mgVO)X10d ENFERNEDAD MODERADA FIEBRE LEUCOCITOSIS DIARREA PROFUSA DOLOR ABDOMINAL VANCOMICINA 4X(125-250 mgVO)X10d SEVERA ILEO PARALÍTICO MEGACOLON TÓXICO DESHIDRATACIÓN SÉPSIS CIRUGIA ? VANCOMICINA INTRALUMINAL INHABILIDAD TTO ORAL CON/SIN MTZ EV

DIARREA ASOCIADA A C difficile EVOLUCIÓN DACD BUENA MEJORÍA CLÍNICA 1-2 DIAS DE INICIADO TTO FIEBRE RESUELVE EN 24-48 HS DIARREA RESUELVE EN 2-5 DIAS NO REPETIR DETECCIÓN DE TOXINAS PARA DEMOSTRAR CURA PORTADOR ASINTOMÁTICO

RECAIDA antes de los 2 meses REINFECCIÓN despues de los 2 meses DIARREA ASOCIADA A C difficile EVOLUCIÓN DACD RECAIDA antes de los 2 meses REINFECCIÓN despues de los 2 meses 12-24% PACIENTES DESARROLLAN UN 2 do E P I S O D I O D E D A C D +/- 2 MESES DEL DIAGNÓSTICO INICIAL

DIARREA ASOCIADA A C difficile MEDIDAS DE PREVENCIÓN PERSONA LAVADO DE MANOS AGUA Y JABÓN GUANTES GUARDAPOLVO HABITACIONES PRIVADAS COHORTIZAR EN AERAS DESIGNADAS LAVANDINA MEDIO AMBIENTE

Vaya hasta el fin... ¡LUCHE!