Epidemiología de las Infecciones asociadas a Shigatoxinas Dr. Eduardo L. López Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutiérrez” Universidad Del Salvador

E.coli Enterohemorrágica (EHEC) Caracterización Se les ha dado el nombre de EHEC por su capacidad de producir brotes de colitis hemorrágica Como producen una potente citotoxina, Shigatoxina, también se las ha llamado STEC Estas bacterias se diseminan por vía fecal-oral Es muy bajo el número de organismos necesarios para producir infección (102 - 202)

EHEC Patogenia y Factores de Virulencia Shigatoxinas (Stxs) Factor de adherencia intestinal: “intimina”, proteína de membrana externa Enterohemolysina Plásmido de O157? Otros factores de virulencia potenciales: LPS, transporte de Fe++

Shiga Toxins (Stxs): Major Characteristics Stxs: Are the major virulence factor and a defining property of EHEC. They are a family of shigatoxins, being the most common members Stx1 and Stx2 A1 peptide: contains the activity Structure: A A2 peptide: binds the A1 to B Two units B: binds the toxin to the specific receptor Gb3 Stxs are encoded on a phase inserted into the chromosome

Comparison of Stx1 and Stx2 Citrobacter freundii, Enterobacter S. dysenteriae Other bacteria More toxic Less toxic HRMVE = Verocell toxicity No affected by iron conc.  High iron conc. Synthesis idem 55 % vs. Stx2 AA Homology Stx2 Stx1 Factor

Infecciones por STEC en humanos Espectro Clínico Portadores asintomáticos Diarrea acuosa Diarrea con sangre colitis hemorrágica Cólicos abdominales (50-70%); prolapso rectal (10%); vómitos (30-50%) Complicaciones Invaginación intestinal Apendicitis Formas Incompletas SUH SUH

Clinical Illness in STEC Infection Incubation period: 2-4 days (inoculum: 102-202 organisms) First manifestations are usually non-bloody diarrhea, abdominal cramps. At the 2nd/3rd day of illness bloody diarrhea develops with low fever. Cramps are an important findings in infants and children If no complication develops, the disease usually resolves within a week

Epidemiologic Patterns in HUS Three epidemiologic patterns have been described: Outbreaks and clusters cases: mainly associated with water and food-borne infection with diarrhea, ie: USA, U. Kingdom, Japan,etc Endemic cases: with an increase of number of cases during spring and summer seasons, ie: Buenos Aires (Argentina), Alberta (Canada), Baviera (Germany) Sporadic cases: are observed throughout the world

Incidence of Hemolytic Uremic Syndrome in Different Areas of the World Children 4 years. Incidence per 100,000 King County Washington Oregon Alberta Canada United Kingdom Chile Uruguay Buenos Aires Argentina

Etiological agents in patients with Diarrhea in Buenos Aires % Shigella EHEC Salmonella Campy EPEC Other Microbiology and infectious Diseases Division

Características y Objetivos del Estudio Estudio Prospectivo Estacional de Niños con Diarrea, seguidos los días 0,2,3, 5 y 10 días. Objetivo Para establecer incidencia de diarrea por E.coli productores de Shigatoxinas y factores de riesgo de desarrollar SUH.

STEC Infections in Argentina Site: Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez” Buenos Aires Screened Patients: N= 1692 Screening Methods: Premier O157/Immunocard STAT Premier EHEC PCR (stx1 and stx2) Buenos Aires, Argentina

Riesgo de SUH en pacientes con Diarrea Población en Estudio* Período de Estudio: 1/98 - 12/00 Pacientes estudiados N=1338 Diarrea con sangre N= 819 (61.2%) Diarrea acuosa N= 519 (38.8%) * Centro: Hospital de Niños “Ricardo Gutiérrez” - Buenos Aires

Synsorb Study - Site Buenos Aires Patients Enrollment Period of Study: Jan 1998 - May 2000 Cumulative Data by Month Buenos Aires, Argentina

Riesgo de SUH en pacientes con Diarrea Población en Estudio % Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00 Hospital de Niños - Buenos Aires

Diarrea asociada a STEC Población en Estudio Número de casos 24,3% 7,9% Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00 Hospital de Niños - Buenos Aires

STEC Associated Diarrhea O157 vs. NON-O157 Infections % Buenos Aires, Argentina

STEC Infections Rate of O157 strains Site: Hospital de Niños “R STEC Infections Rate of O157 strains Site: Hospital de Niños “R. Gutiérrez” % Buenos Aires, Argentina

STEC Infections in Argentina Age Distribution % months 7-12 BD: p<0.03 HUS: p=0.00002 Hospital de Niños - Buenos Aires IDSA 1999 - Philadelphia, USA

Diarrea Sanguinolenta y Riesgo de SUH Diarrea con sangre: N=819 STEC-Diarrea con sangre: N= 199 SUH si no si 19 180 D.S. no 1 619 p<0.0000001 X2= 51.84 Hospital de Niños - Buenos Aires

Risk of HUS in STEC-Diarrhea Nº of patients: 668* HUS Yes No BD-Stx(+) 23 487 p=0.04 RR:7.1 OR:7.4 WD-Stx(+) 1 157 * Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day8, and Day 14) Hospital de Niños - Buenos Aires

Risk of HUS in Bloody Diarrhea Nº of patients: 1318+ Bloody Diarrhea HUS Yes No Stx(+) 23 487 p<0.000005 RR:7.3 OR:7.6 Stx(-) 5 803 * Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day 8, and Day 14) Hospital de Niños - Buenos Aires

Tipo de Shigatoxinas aisladas en Pacientes con SUH (I) Stx(+): 149 (62.1%) N= 240 Stx (-): 91 (37.9%) Se identificó tipo de toxina en 104/149 (69.8%) Técnicas de detección de toxina: Cultivo Celular (Ensayo de citotoxicidad con neutralización) Métodos de Diagnóstico Rápido PCR Hospital de Niños - Buenos Aires

Tipo de Shigatoxinas aisladas en pacientes con SUH (II)* Metodología: Cultivo Celular c/neutralización y/o PCR N=106 % (n=24) (n=54) (n=18) * Hubo 8 pacientes con SUH que presentaron cepas con Stx-II y cepas con Stx-I/II En 2 pacientes no se pudo identificar tipo de toxina Hospital de Niños - Buenos Aires

Type of Toxin in Patients with HUS Center: Hospital de Niños “R Type of Toxin in Patients with HUS Center: Hospital de Niños “R. Gutiérrez” N=70* % *PCR positive Period of Study 1997 - 2000 Buenos Aires, Argentina

Riesgo de SUH en pacientes con Diarrea con Sangre según Tipo de Toxina Número de casos Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00 Definición tipo de Toxina: PCR Hospital de Niños - Buenos Aires

Evidencia de Citotoxinas en Convivientes SLT-I y/o II en Materia fecal Madres: 16/30 Hermanos: 5/9 vs. Padres: 4/25 p < 0.05 Correlación entre tipo de toxina en caso índice (SUH) vs. convivientes = x2 35.32 p < 0.0001 Citotoxina libre en materia fecal (+) se correlacionó con serología (+) en convivientes 18/20 (90%) vs. 21/35 (60%) p < 0.02 López EL y col. Pediatr Infect Dis J 1991; 10:20-4

Value of Rapid Methods to Detect Shigatoxin-producing E Value of Rapid Methods to Detect Shigatoxin-producing E.coli (STEC) Infections in Children with Diarrhea and HUS in Buenos Aires From Jan, 1998 to Dec, 2000, 1338 stool samples from patients less than 5 days of diarrhea, were studied for diagnosis of STEC infections. During the same period 105 HUS patients also were studied. All samples were tested by: SMAC Culture Premier E.coli O157 or Immunocard STAT O157 Premier EHEC PCR for stx genes (swab from MacConkey sorbitol plates culture or E.coli isolates) IDSA 2001 - San Francisco, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Sensitivity and specificity of SMAC Culture vs Sensitivity and specificity of SMAC Culture vs. Premier O157/Immunocard STAT O157 in Patients with Diarrhea and HUS No. of cases: 1443 SMAC Culture (+) (-) (+) 63 14 Premier O157 ImmunocardSTAT (-) 2 1364 OR: 30.69 Chi square:1130.3 p< 0.0001 Sensitivity: 96.9% Specificity: 98.9% Predictive Positive Value: 81.8% Predictive Negative Value: 99.8% IDSA 2001 - San Francisco, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Sensitivity and specificity of Premier O157/ Immunocard STAT O157 vs Sensitivity and specificity of Premier O157/ Immunocard STAT O157 vs. PCR in HUS patients No. of cases: 105 Premier O157/Immunocard STAT O157 (+) (-) (+) 13 21 PCR (-) 1 62 OR: 38.38 Chi square: 24.02 p< 0.0001 Sensitivity: 92.8% Specificity: 74.6% Predictive Positive Value: 38.2% Predictive Negative Value: 98.4% IDSA 2001 - San Francisco, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Sensitivity and specificity of Premier EHEC vs. PCR in E Sensitivity and specificity of Premier EHEC vs. PCR in E.coli O157 Diarrhea Children No. of cases: 69/1338 Premier EHEC (+) (-) (+) 56 3 PCR (-) 2 8 OR:74.67 Chi square: 35.81 p<0.0001 Sensitivity: 97% Specificity: 73% Predictive Positive Value: 95% Predictive Negative Value: 80% IDSA 2001 - San Francisco, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Sensitivity and specificity of Premier EHEC vs. PCR in E Sensitivity and specificity of Premier EHEC vs. PCR in E.coli NON-O157 Diarrhea Children No. of cases: 1269 Premier EHEC (+) (-) (+) 95 24 PCR (-) 46 1104 OR: 95 Chi square: 627.89 p<0.0001 Sensitivity: 73% Specificity: 98% Predictive Positive Value: 80% Predictive Negative Value: 96% IDSA 2001 - San Francisco, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Factores de Riesgo Hematológicos en Análisis de Rutina

White Blood Cell Count as Risk to Develop HUS/Incomplete HUS in BD-Stx(+) WBC count (Mean) (x109/L) P<0.000001 Chi: 26.9 (N= 118) (N=62) BD: WBC (X ± SD): 11.5 ± 4.6 (x109/L) HUS: WBC (X ± SD): 15.9 ± 5.8 (x109/L) IDSA 1999 - Philadelphia, USA Hospital de Niños - Buenos Aires

Valores de Plaquetas en pacientes con Formas Incompletas de SUH* Plaquetas x 1000 Días después del comienzo de la Diarrea * López E L et al: J of Pediatrics, 1995 Hospital de Niños - Buenos Aires

Risk Factors to develop HUS Age: < 5 years Bloody Diarrhea Bloody Diarrhea Stx(+) Shigatoxin Type II (Stx-II) White Blood Cells Count >15.000/mm3 Hospital de Niños - Buenos Aires

Síndrome Urémico Hemolítico: Es una Enfermedad Prevenible ? Opciones: Cambios culturales en la cocción de la carne Uso de antibióticos y/o quimioterápicos que no causen aumento en la producción de toxina Decontaminación de carnes y/o ganado en pie Uso de análogos del receptor (Synsorb-Pk®) Anticuerpo monoclonales: TMA-15 (contra VT2) Vacunas

Análisis Preliminar del Estudio Fase III de SYNSORB PK TIPO DE ESTUDIO: ESTUDIO FASE III, MULTICENTRICO, RANDOMIZADO DOBLE CIEGO VERSUS PLACEBO OBJETIVO DEL ESTUDIO: DETERMINAR LA EFICACIA DE SYNSORB EN LA PREVENCION DE SUH PUNTO PRIMARIO DE EVALUACION: DESARROLLO DE SUH

RESULTADOS PRELIMINARES DEL ESTUDIO SYNSORB PK VS. PLACEBO POBLACION ESTUDIADA: 526 niños PACIENTES ESTUDIADOS EN ARGENTINA: 306 niños (58.2%) 526 niños con diarrea 263 (50%) SYNSORB 263 (50%) PLACEBO

RESULTADOS PRELIMINARES DEL ESTUDIO SYNSORB PK VS. PLACEBO RESULTADOS EN EL TOTAL DE PACIENTES ENROLADOS: En los 526 niños con diarrea STEC (+) tratados dentro de los cinco días de comienzo de la diarrea, no hubo diferencias significativas entre el grupo que recibió SYNSORB PK vs. PLACEBO. Solo se observó una tendencia limitada de mayor eficacia en el grupo SYNSORB PK.

RESULTADOS PRELIMINARES DEL ESTUDIO SYNSORB PK VS. PLACEBO PACIENTES INCORPORADOS DENTRO DE LAS 48 HORAS DE APARICION DE LA DIARREA N= 152 niños con Diarrea STEC (+) SYNSORB PK N = 71 PLACEBO N = 81

Resultados Preliminares del Estudio Fase III de SYNSORB PK VS. PLACEBO % N=66 N=67 N=14 P =0.05 N=5 SYNSORB PK DISMINUYO EL RIESGO VS. PLACEBO EN 59%, EN PACIENTES CON  48hs DE DIARREA

Diarrea asociada a STEC Opciones Terapéuticas Análogos del Receptor para Shigatoxinas (Gb3)? (Synsorb-Pk™), “Starfish”. Solamente? Asociado con antibióticos? Antibióticos solamente? Anticuerpos Monoclonales Humanizados? Vacunas?

Tratamiento C/ATB de Diarrea por E.coli O157 y Riesgo de SUH * Nº de infectados por E. coli O157: 71 niños  SUH: 10 (14%) * Wong C., et al: N- Engl. J. Med 2000; 342 : 1930-6

Uso de TMS-SMX y Riesgo de SUH en pacientes con diarrea sanguinolenta SI NO COTRIMOXAZOL SI NO 11 4 223 17 p=0.025

Efecto de ATB/ Quimioterápicos vs Efecto de ATB/ Quimioterápicos vs. Riesgo de SUH en niños con diarrea sanguinolenta SUH SI NO SI 38 2 196 18 ATB NO p=0.74

Efecto de los antibióticos sobre la producción de Shigatoxinas in vitro

Quinolonas y Producción de Toxinas in vitro ** Se utiliza E.coli O157 (cepa 1:361 R) en cultivo de 8-12 hs. ** Zhang X. et al. JID 2000; 181:664-70

Quinolonas y Producción de Toxinas en Ratones * Aumento de la excreción fecal de Stx * CIPROFLOXACINA  en 6/6 ratones * FOSFOMICINA  en 6/6 Mortalidad en ratones * CIPROFLOXACINA: 4/6 muertes, aquellos con mayor excreción * FOSFOMICINA: no mortalidad * PBS: no mortalidad * Zhang X. et al. JID 2000; 181:664-70

Caracterización Genes de Shigatoxina circulante en Buenos Aires Estudio realizado en cepas de STEC aisladas de pacientes con Diarrea con Sangre y en pacientes con SUH Característica de las cepas: PCR-Stx (+) Método de Estudio: PCR y análisis RFLP (enzimas de restricción) Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños - Buenos Aires

Tipos de Toxina Muestras de Materia Fecal PCR (+) % (n= 99) (n=38) Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños - Buenos Aires

Caracterización de genes para Shigatoxina* * Aislamientos con PCR-Stxs (+) Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños - Buenos Aires

Variantes de Genes de Stx-2 según cuadro clínico % Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños Buenos Aires

Variantes de genes para Stx-2 en cepas de E. coli O157 vs Variantes de genes para Stx-2 en cepas de E.coli O157 vs. No- O157 Pacientes con Diarrea con Sangre Número de cepas P<0.0000001 Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños - Buenos Aires

Conclusiones El genotipo Stx-2 + STx-2a fue prevalente en pacientes con Diarrea con Sangre (63.1% y en pacientes con SUH (69.3%) El genotipo Stx-2 + Stx-2b y Stx-2b no se encontraron en pacientes con SUH El genotipo STx-2 + Stx-2a fue más frecuentemente encontrado en cepas de E.coli O157 que en cepas No-O157 (p<0.0000001) Hospital de Niños - Buenos Aires Abstract Submission IDSA 2002

Estos datos preliminares sugieren que el uso de Anticuerpos Monoclonales como terapéutica potencial, deberían neutralizar los genotipos stx-2 y/o stx2 + stx-2a en Argentina Abstract Submission IDSA 2002 Hospital de Niños - Buenos Aires

Infecciones por STEC Estudio prospectivo en niños de 6 meses a 14 años Período de estudio: Enero 1998 - Abril 2000 (septiembre-abril) Pacientes en Screening: n=1654 Tipo de diarrea: Con sangre 61.8% Acuosa 38.2%

Risk of HUS/Incomplete HUS in STEC-Diarrhea No. of patients: 463+ HUS/Incomplete HUS Yes No BD-Stx(+) 25 306 WD-Stx(+) 1 131 P<0.008 RR: 10 OR: 10.7 +Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day 8, and Day 14)

Risk of HUS/Incomplete HUS in Bloody Diarrhea Yes No Stx(+) 25 306 Bloody Diarrhea Stx(-) 9 624 No. of patients: 964+ P<0.000002 RR: 5.3 OR: 5.7 +Prospective follow-up in STEC-Diarrhea (Day 0, Day 3, Day 8, and Day 14)

Métodos de Estudio Métodos de Screening Tests Confirmatorios SMAC agar Premier O157 (Meridian Diagnostic, Co.) Immunocard Stat O157 Plus (Meridian Diagnostic, Co) Premier EHEC (Meridian Diagnostic, Co) Latex Test Agglutination E.coli O157 (Oxoid) Tests Confirmatorios PCR (para genes stxs-I y II, eaeA y hlyA )

Patients were studied during spring and summer season Study Population 13.5 % 317.9 (118.2) 51 Healthy Adults 42.7 % 73.6 (47.6) 202 Healthy Children 57.1 % 29.7 (30.2) 811 Watery Diarrhea 54.2 % 33.4 (28.2) 1318 Bloody Diarrhea 48.2 % 17.9 (11.3) 240 HUS Sex (Male) Age (months) X ( SD) Nº Group Patients were studied during spring and summer season

STEC Infections: Outbreaks and Endemic Disease USA: 139 E.coli O157 between 1982-1996 England and Wales: 55 STEC between 1983-1996 Canada: 316 E.coli O157 between 1982-1995 Continental Europe: 17 STEC were reported from nine countries Reported outbreaks Argentina Chile Baviera (Germany) Endemic disease

Type of Toxin in Patients with BD (Synsorb Study) Center: Hospital de Niños “R. Gutiérrez” % *PCR positive Period of Study 1998 - 2000 Buenos Aires, Argentina

Riesgo de SUH Según Tipo de Toxina % Período de Estudio: Enero´98 - Diciembre´00 Definición tipo de Toxina: PCR Hospital de Niños - Buenos Aires

Premier E. coli O157/Immunocard STAT O157: directly from raw stool Premier E.coli O157/Immunocard STAT O157: directly from raw stool. The test is a rapid invitro microwell procedure for the qualitative determiantions of Escherichia coli O157 antigen in feces. It was used as a screening tool to allow rapid presumptive determination follows SMAC culture plates. SMAC Culture: for identification of non-sorbitol fermenter colonies, and E.coli strains isolation (sorbitol fermenters and non-fermenters). Premier EHEC: it was used as a rapid in vitro microwell EIA for detection of stx-1 and stx-2 in stool specimens and MacConkey broth culture. PCR assay: it was performed on DNA obtained from swab of SMAC culture plates and/or 10-20 E.coli isolated strains. Multiplex PCR using Strockbine´s primers were used to detect stx-1 and stx-2 genes. After amplification, a 894 bp and 478 bp fragment for Stx-1 and 2 were observed, respectively.

Conclusions STEC infections are more frequent in Bloddy Diarrhea than Watery Diarrhea (p<0.0001) Non-O157 STEC infections are more common than O157 infections in Argentina (p=0.003) Premier EHEC sensitivity and specificity was 97% and 73% in O157 infections in children with diarrhea and 92.3% and 98.8% in HUS with O157 infections Premier EHEC sensitivity and specificity was 73% and 98% in Non-O157 infections in diarrhea patients and 65% and 84.5% in HUS patients with Non-O157 intfections, respectively There is a high correlation between SMAC Culture (confirmed by Oxoid Latex Agglutination test for E.coli O157) vs. Premier O157 / Immunocard STAT O157, in children with Diarrhea and HUS patients