PRÁCTICO N° 5 Interacciones microorganismos - planta Objetivo: Conocer las técnicas de laboratorio para el manejo de microorganismos que interactúan con las plantas Interacciones más comunes Positivas (sinérgicas) Simbiosis (micorrizas, rizobios) Mutualismo (Azozpirillum) Negativas (antagónicas) Competencia Amensalismo Aislamiento de microorganismos Selección de cepas Producción de inoculantes Técnicas de laboratorio

Simbiosis: micorrizas Ectomicorrizas Endomicorrizas Intercelulares Manto externo Raíz modificada Hongos superiores Cultivables Intercelulares e intracelulares Sin manto externo Sin raíz modificada Hongos inferiores No cultivables

Aislamiento de microorganismos: rizobios incubar estriar en medio YEM cortar la raíz lavar seleccionar nódulos turgentes extraer los nódulos desinfectar con H2O2 (5minutos) macerar enjuagar con H2O estéril 1 ml de H2O estéril repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar

Aislamiento de microorganismos: rizobios Extraer los nódulos Raíz de leguminosa Enjuagar con H2O estéril Desinfectar con H2O2 (20%) 5 minutos

Aislamiento de microorganismos (rizobios) Colocar los nódulos en un tubo con 1ml de agua estéril Macerar con varilla de vidrio Incubar (28-30° C) Estriar en medio YEM Extraer una alícuota

Aislamiento de microorganismos (rizobios) Colorear y observar Cultivo de rizobio Incubar y conservar Repicar a “pico de flauta”

Síntesis de aislamiento de rizobios incubar estriar en medio YEM cortar la raíz lavar seleccionar nódulos turgentes extraer los nódulos desinfectar con H2O2 (5minutos) macerar enjuagar con H2O estéril 1 ml de H2O estéril repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar

Aislamiento de microorganismos: Azospirillum incubar cortar raíz lavar 1 g de raíz colocar en H2O estéril y agitar extraer alícuota sembrar en medio NFB semisólido crecimiento de Azospirillum aislamiento en medio NFB sólido repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar

Suspender en H2O estéril Aislamiento de microorganismos: Azospirillum Gramínea Cortar raíces Suspender en H2O estéril Extraer alícuota Agitar

Aislamiento de microorganismos: Azospirillum Incubar Sembrar en medio NFB semisólido Halo de crecimiento de Azospirillum Repicar a “pico de flauta" Incubar y conservar

Síntesis de aislamiento de Azozpirillum incubar cortar raíz lavar 1 g de raíz colocar en H2O estéril y agitar extraer alícuota sembrar en medio NFB semisólido crecimiento de Azospirillum aislamiento en medio NFB sólido repicar (pico de flauta) colorear (Gram -) conservar

Selección de cepas para capacidad fijadora de N Ensayo de laboratorio: alfalfa Medio de cultivo: Yensen Testigo: medio sin N sin inocular Control: medio sin N inoculado con cepa eficiente Tratamientos: medio sin N inoculados con cepas a testear Testigo: medio con N sin inocular

Síntesis de selección de cepas Testigo medio sin N sin inocular Control inoculado con cepa eficiente Tratamientos inoculados con cepas a testear medio con N

Selección de cepas: parámetros de evaluación Cantidad de nódulos Color Posición en la raíz Actividad Nasa N en planta Peso de raíz

Síntesis de producción de inoculante incubar (4-5 días) filtro de aire manguera aireador cámara de aire 30% incubar 3 o 4 días extraer una alícuota de cultivo conservado cultivar en medio YEM liquido (pie de cuba) colorear (control del pie de cuba) agregar antibiótico colocar el pie de cuba (control del inoculante) Primera etapa cultivo de iniciación (pie de cuba) Segunda etapa cultivo a gran escala (biodigestor) 50 ml Medio Ashby (estéril)

Producción de inoculantes Mangueras Tapones Biodigestores Filtro de aire Mechero Aireador

Producción de inoculantes Planta Industrial

Actividades Micorrizas: observar raíces de pino Rizobios: observar bacteroides y bacterias Producción de inoculantes: observar un biodigestor