Dugour A, Marazita M, Suburo A, Figueroa JM EFECTOS DEL HUMO DE CIGARRILLO EN CULTIVOS DE EPITELIO RESPIRATORIO Y RETINIANO HUMANOS: ESTRÉS OXIDATIVO E INFLAMACIÓN Dugour A, Marazita M, Suburo A, Figueroa JM Buenos Aires

DEGENERACION MACULAR ASOCIADA A LA EDAD (DMAE) Mácula: mancha amarillenta en la retina. visión central, fotopica, detalles, letras, caras. ausencia de bastones, formada solo por conos y epitelio pigmentario denso. gran contenido de pigmentos xantofílicos (luteína, zeaxantina= fotoprotectores). DMAE afecta a los componentes de la retina externa Fotoreceptores Epitelio Pigmentario Retiniano Coroides retinografia

Factores de riesgo DMAE: EPR: separa fotorreceptores de coroides (vascular) barrera, intercambio de nutrientes, iones, factores tróficos absorbe luz, contiene antioxidantes regula inmunidad ocular La DMAE se caracteriza por la aparición de anomalías histologicas: - neovascularización - fibrosis - remodelación DMAE Factores de riesgo DMAE: EDAD Tabaquismo asociación DMAE-EPOC

DMAE: fisiopatología propuesta ROS antioxidantes DMAE ROS antioxidantes EPOC ROS antioxidantes salud

Produce y libera factores reguladores de INMUNIDAD, INFLAMACION, TEJIDO EPITELIAL El tejido epitelial es básicamente un tejido de cubrimiento. Se especializa en absorber, secretar, transportar, excretar o proteger los órganos que recubre. Estas células mueren y se regeneran constantemente. Produce y libera factores reguladores de INMUNIDAD, INFLAMACION, y PROLIFERACION

modelos utilizados para el estudio de la EPOC y la DMAE OBJETIVO: Profundizar en el conocimiento del daño que causa el HC en cultivos de células de epitelio respiratorio y retiniano in vitro y buscar similitudes y diferencias entre los mecanismos participantes en ambos casos Cultivos de líneas celulares de EPITELIO RESPIRATORIO y RETINIANO: modelos utilizados para el estudio de la EPOC y la DMAE Cultivo de células epiteliales en monocapa: permite estudiar la actividad de estas células en una disposición similar a la que tienen en el individuo y al mismo tiempo independientes de toda influencia de otras células (del conectivo, del sistema inmune, etc.).

Modelo de epitelio bronquial (Calu-3) Morfológicamente representativo del epitelio bronquial - Se cultivan en monocapa. Desarrollan uniones tight junction. Muy similares a cultivos primarios. Expresan CFTR. Capacidad de secreción de moco al medio apical. Sintetizan y liberan IL-8, IL 6, VEGF, etc.

CONCENTRADO DE HUMO DE CIGARRILLO (CHC) Reference Cigarette Program. College of Agriculture. Universidad de Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig

Tratamiento de los epitelios CHC NAC Medio de cultivo (C) CHC CHC + N-Ac.Cist. (NAC: antioxidante) Valoraciones Sobre la monocapa de células: 1)Viabilidad celular: - LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity, Life Technologies -The CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, EEUU). 2) Inducción de ROS Mediante la sonda diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) (Molecular Probes). En el sobrenadante: 3) Inducción de inflamación: ELISA de Captura (Human IL-8/IL-6 ELISA Set, BD Bioscienses).

Viabilidad Celular. Epitelio Respiratorio. CHC 200 µg/ml Análisis de la morfología celular con microscopia de fluorescencia. Celulas CALU – 3. Aumento 400 x. Luego de 72 horas post-tratamiento las células se tiñeron con los colorantes del kit LIVE/DEAD® (green-fluorescent calcein y red-fluorescent). Verde (filtro Ex 450-490, DM 500, BA 515) Rojo (filtro Ex 541-551, DM 565, BA 590). El CHC tiene un efecto citotóxico, promoviendo la muerte celular en células CALU-3.

Viabilidad Celular. Epitelio Retiniano. CHC 200 µg/ml Análisis de la morfología celular con microscopia de fluorescencia. Celulas ARPE-19. Aumento 200 x. Luego de 72 horas post-tratamiento las células se tiñeron con los colorantes del kit LIVE/DEAD® (green-fluorescent calcein y red-fluorescent). Verde (filtro Ex 450-490, DM 500, BA 515) Rojo (filtro Ex 541-551, DM 565, BA 590). El CHC tiene un efecto citotóxico, promoviendo la muerte celular en células ARPE-19.

Estrés Oxidativo. Epitelio Respiratorio Celulas CALU-3 1-Sonda DCFDA 30 min. 2-CHC y CHC+ NAC 15 min. Microscopio de fluorescencia (ex 460–480 nm y em a 495–540 nm). Programa: ImageJ 1.42. p <0,05. Tukey test El CHC aumenta los niveles de intracelulares de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células CALU-3. NAC previene el efecto de CHC sobre las ROS.

Estrés Oxidativo. Epitelio Retiniano Celulas ARPE-19. 1-Sonda DCFDA 30 min. 2-CHC/CHC+NAC 15 min. Cuantificacion de ROS en un Luminometro p <0,05. Tukey test El CHC aumenta los niveles intracelulares de ROS en células ARPE-19. NAC previene el efecto de CHC sobre las ROS

Inducción de Inflamación. Epitelio Respiratorio p < 0.05 Newman-Keuls Multiple Comparison Test CALU-3. CHC 100 µg/ml y CHC 100 µg/ml + NAC 5 mM 24 hs. Se cuantifico la IL-6 y la IL-8 liberada por ELISA de Captura. Los resultados representan el promedio ± SE de 5 ensayos independientes realizados por cuadruplicado. El CHC aumenta los niveles de IL-6 e IL-8 liberados por las células CALU-3. NAC previene este efecto

Senescencia. Epitelio Retiniano ARPE-19 CHC / CHC+NAC por 3 días y luego mantenidas por 9 días más en medio fresco. La actividad de SA-βgal fue estudiada por tinción con el sustrato X-gal. Se evaluaron 3 pocillos por tratamiento. Figura representativa de 3 ensayos independientes El CHC induce senescencia celular en cultivos de células ARPE-19. NAC previene dicho efecto.

Inducción de Inflamación. Epitelio Respiratorio *** p<0.01 .Newman-Keuls Multiple Comparison Test ARPE-19 senescentes. CHC 100 µg/ml y CHC 100 µg/ml + NAC 5 mM. Se cuantifico la IL-6 y la IL-8 liberada por ELISA de Captura. Los resultados representan el promedio ± SE de 5 ensayos independientes realizados por cuadruplicado. El CHC aumenta los niveles de IL-6 e IL-8 liberados por las células ARPE-19. NAC revierte el efecto

Conclusiones El CHC reduce la viabilidad celular en nuestros modelos.. El CHC induce un aumento intracelular de ROS. El hecho de que la NAC bloquee completamente el aumento de ROS y la liberación de IL-6 e IL-8 en nuestras células implica que el aumento de ROS es un paso ineludible en la generación de inflamación mediada por estos epitelios ante la exposición al CHC.. Las semejanzas en los mecanismos de daño entre ambos epitelios explican la asociación epidemiológica entre ambos. Nuestros modelos parecen aptos para el estudio de fármacos con acción antioxidante en vistas a nuevos tratamientos para la EPOC, la DMAE, y la asociación entre ellas.

Gracias por su atención !! www.fundacioncassara.org.ar adugour@fundacioncassara.org.ar

Viabilidad Celular. Epitelio Respiratorio. La incubación simultánea con CHC y NAC 2,5 mM previene significativamente el daño causado por el CHC