Perspectivas Fig. 2.2 Péptido obtenido por digestión virtual de la cTXNPx que contiene la C p y la Cys ,5435 (=3347, ) (= ) B ANÁLISIS DE LA OXIDACIÓN DE CISTEÍNAS EN LA TRIPARREDOXINA PEROXIDASA CITOSÓLICA DE TRYPANOSOMA CRUZI 1,2 Gardner, M., 1,3 Arcari, T., 1,3 Piñeyro, M.D., 2 Parodi-Talice, A., 1,3 Robello, C. 1 Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur de Montevideo; 2 Sección Genética, Facultad de Ciencias, UdelaR; 3 Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR. Durante su ciclo de vida Trypanosoma cruzi invade las células de sus hospederos vertebrados. Dentro de dichas células, el parásito está expuesto a especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, producidas por sus propios procesos de respiración celular o por mecanismos de defensa del huésped, que pueden resultar letales. En respuesta a dichos mecanismos los tripanosomátidos han desarrollado sistemas de detoxificación entre los cuales se encuentra el sistema de enzimas antioxidantes formado por la Triparredoxina y la Triparredoxina Peroxidasa citosólica (TXN-cTXNPx), que elimina las especies reactivas. cTXNPx es una peroxirredoxina de 2-Cys típica (Prx de 2-Cys). Estas enzimas son capaces de reducir peróxidos a expensas de residuos de cisteína reactivos. Durante el ciclo catalítico, el grupo tiol de la cisteína peroxidática (C P ) es oxidado al reaccionar con H 2 O 2, formándose un derivado sulfénico (Cys-SOH) y posteriormente un puente disulfuro. Cuando la concentración de H2O2 es elevada, la C P (Cys52) puede reaccionar con una segunda molécula de H2O2, formándose un derivado sulfínico (Cys-SO 2 H), obteniéndose una forma de la enzima que carece de actividad catalítica. Introducción Al igual que la gran mayoría de las Prx de 2-Cys, la cTXNPx posee una estructura decamérica formada por un pentámero de dímeros. Además de las cisteínas involucradas en la actividad peroxidasa, Cys 52 y Cys 173, la enzima posee otros cinco residuos de Cys. Dos de ellos, la Cys 57 y Cys 111, se hallan expuestos al solvente. Estos residuos de Cys podrían actuar también como sensores de los niveles de H 2 O 2 intracelulares. m/z (mi)ModificationsStartEndSequence Met-ox3864(K)WLVLFFYPMDFTFVCPTEICQFSDRVK(E) Resultados 1. Caracterización de la cTXNPx wt y mutantes en residuos de Cys por electroforesis bidimensional. En todos los casos las cTXNPx (10 μg) se incubaron durante 20 min a T amb en presencia de 1 mM DTT (reducción) o 2mM H 2 O 2 y 1 mM DTT (oxidación). Se sembraron 5 μg de proteína en tiritas Immobiline DryStrip pH 4-7 de 7 cm (GE Healthcare). cTXNPxC52s Ox. Red. cTXNPxC111S Ox. Red. cTXNPxC57S Ox. Red. cTXNPxC173S Ox. Red. 3. Detección de la formación de cTXNPx-SO 2 H (C52) en la enzima wt y mutantes en residuos de Cys. Fig 3.1 Fig kDa C52S red C52S ox C57S red C57S ox C111S red C111S ox C173S ox C173S red A B 50 kDa Fig 3.1 Western Blot de cTXNPx wt incubada en condiciones de oxidación. En todos los casos se incubó la enzima a T amb (0,4 μg) durante 20 min, con 10 mM DTT y las concentraciónes de H 2 O 2 indicadas. Se utilizaron anticuerpos  - cTXNPx (A) y  -Prx-SO 2 H (B). Conclusiones  Se observaron modificaciones en el perfil electroforético bidimensional de la cTXNPx al incubarla con H 2 O 2. Estos mismos cambios se observaron para dos de los mutantes (Cys52 y Cys111).  Detectamos la sobreoxidación de la C P mediante western blot. La concentración de la cTXNPx sobreoxidada aumenta con la concentración de H 2 O 2 (Fir. 3.1). También confirmamos la sobreoxidación de la C P en los mutantes de la Cys 57, Cys111 y Cys173 No se detecta sobreoxidación en la proteína mutante de la Cys 52, en que este residuo se encuentra reemplazado por un residuo de Serina.  Identificamos el péptido que contiene la C P por espectrometría de masa y un pico que correspondería al mismo péptido pero con modificaciones que podrían estar asociadas a la sobreoxidación de la C P. Sin embargo, la presencia de la Cys57 en el mismo péptido no nos permite confirmar dicha suposición. cTXNPx Reducida Oxidada pI 4 7 H2O2H2O2 0 0,1 0, mM 24 kDa 50 kDa A B Además realizamos estudios utilizando la enzima AspN (de Pseudomonas fragi), una endopeptidasa que provoca cortes en la posición anterior a los residuos de ácido aspártico y residuos de cisteína modificados (ácidos sulfínico y sulfónico). A partir del estudio de la proteína reducida en solución (sin pasar por gel), pudimos obtener una cobertura de secuencia del 97% por espectrometría de masas. El siguiente paso sería el estudio de la proteína oxidada en solución (sin pasar por gel) para poder confirmar la oxidación de los residuos de cisteína de interés. La inactivación de las Prxs por sobreoxidación forma parte de un mecanismo de regulación que le permitiría al H2O2 participar en cascadas de señalización intracelular. Y resulta de gran interés ya que es un posible blanco para el desarrollo de drogas contra tripanosomátidos. 2. Caracterización de la cTXNPx wt por espectrometría de masa A Fig 2.1 Digestión tríptica de la cTXNPx wt y espectros correspondientes al análisis por TOF-TOF. Proteína reducida (A) y spot ácido de la proteína oxidada (B).  Confirmación mediante espectrometría de masas de la presencia de residuos de cisteína oxidados y sobreoxidados en la proteína tratada en solución.  Trasladar estos estudios al sistema in-vivo y obtener confirmación de los resultados mediante el tratamiento de cultivos de parásitos con concentraciones variables de peróxido de hidrógeno. Fig 3.2 Western Blot de las cTXNPx mutantes en condiciones de reducción y oxidación. En todos los casos se incubaron (0,4 μg) de las enzimas a Tamb durante 20 min, con 10 mM DTT (condiciones reductoras) o con 2 mM H2O2 y 10 mM DTT (condiciones oxidativas). Se utilizaron anticuerpos  -cTXNPx (A) y  -Prx-SO2H (B). 1.Caracterización de la cTXNPx wt y cuatro mutantes en residuos de Cys (C52S, C57S,C111S y C173S) por electroforesis bidimensional en condiciones de oxidación-reducción. 2.Análisis por espectrometría de masa de los péptidos obtenidos por digestión con tripsina de la proteína cTXNPx. 3.Detección del estado de oxidación de la C P de la proteína salvaje y las mutantes por western blot, utilizando un anticuerpo anti-PrxSO 2 H. Objetivos