Producción de xantófilas a partir de Scenedesmus sp Autores: Luis A Kieffer1,2, Patricia de la Sierra1,2, Melina Devercelli3, María Claret4, Estefanía Leiz4 1 Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas (UNL). Ciudad Universitaria. Ruta Nacional N° 168 - Km 472,4. (3000) Santa Fe ; 2 INTEC (UNL – CONICET). Guemes 3450 (3000) Santa Fe; 3INALI (UNL – CONICET). Ciudad Universitaria. Ruta Nacional N° 168 - Km 472,4. (3000) Santa Fe; 4Fundación VINTEC. Guemes 3450 (3000) Santa Fe - Autor de contacto: lkieffer@santafe-conicet.gov.ar Producción de xantófilas a partir de Scenedesmus sp Introducción Las xantofilas, derivados oxigenados de los carotenoides, abundan en los vegetales aunque también se encuentran en el reino animal (yema de los huevos). Las mismas son antioxidantes potentes que actúan protegiendo los tejidos de los daños causados por los radicales libres. Son utilizadas como suplementos dietarios tanto por su actividad antioxidante, como por su papel fundamental en las funciones de la mácula. Las fuentes naturales para su obtención son los pétalos de caléndula y las microalgas. Extracción y purificación Separación de la biomasa del medio de cultivo Se separaron las algas del medio de cultivo (el cual es reutilizado) por decantación. Las muestras fueron secadas a 50ºC durante 3 horas con corriente de aire. Ruptura de la pared celular Se compararon diferentes métodos para la ruptura de la pared celular (molino a bolas, baño de ultrasonido, congelado y descongelado, grinder y mortero). Los mejores resultados se obtuvieron con mortero. Saponificación Las muestras fueron sometidas a tratamiento alcalino con una solución alcohólica (al 50%) de hidróxido de potasio 4% durante 10 minutos. Extracción Para la extracción se probaron diferentes proporciones de solventes (etanol, acetona, acetato de etilo y hexano). La extracción más eficiente fue con una mezcla de hexano (50%) acetona (25%) y etanol (25%). Las muestras saponificadas se extrajeron con la mezcla de solventes con agitación vigorosa durante 2 minutos y posterior centrifugación. Luego se realizaron sucesivas extracciones con hexano hasta que la fase orgánica fue incolora. Las muestras se concentraron en rotavapor a 40ºC para eliminar el hexano y luego se redisolvieron en 1 ml de metanol (con 0.01% BHT para evitar la oxidación). Este extracto se filtró por membrana de 0.2µm y se analizó por HPLC. Determinación de xantófilas La concentración de xantófilas (expresados como luteína) se realizó mediante cromatografía líquida en fase reversa con las siguientes condiciones: HPLC Waters 1525, Columna: C18 (5µm, 4.6 mm x 150 mm), Fase movil: (A) 90% metanol 10% agua y (B) 90% metanol 10% acetato de etilo, ambas con 0.05% de trietilamina Gradiente: 100% (A) durante 4 minutos, gradiente lineal a 100 % (B) en 4 minutos y 100% de (B) durante 7 minutos Flujo: 1 ml/min Temperatura de 30 ºC, D Detector Waters 2487 UV-Vis Longitud de onda: 450 nm Cultivo de algas Para la obtención de xantófilas se utilizó la especie de algas verdes Scenedesmus sp. que fue aislada de ambientes acuáticos cercanos a la ciudad de Santa Fe, siguiendo la metodología estandarizada para estudios microbiológicos. Se realizaron cultivos a escala laboratorio en 3 sistemas: 1) recipientes de vidrio de 440 ml de capacidad 2) pecera de 25 litros 3) bolsas plásticas de 5 litros. Diferentes medios de cultivo (Chun 10, Acorinti y Bold Basal), fuentes y concentraciones de C, N y P, fuentes de luz y temperaturas de crecimiento fueron analizadas y comparadas. Los cultivos se mantuvieron en las condiciones elegidas 7 días, durante los cuales se controló el pH y el crecimiento (por colorimetría a 600 nm). Se determinó la biomasa final por gravimetría y la producción de carotenoides mediante HPLC. Las mejores velocidades de crecimiento se obtuvieron con las siguientes condiciones: medio de cultivo basal de Bold, modificado para cumplir la proporción de Redfield utilizando bicarbonato como fuente de carbono y nitratos como fuente de nitrógeno, iluminación permanente con tubos fluorescentes y LEDs rojos y azules, temperatura 30ºC, agitación y ajustando el pH entre 8 y 9. Resultados y conclusiones Los mejores rendimientos, alcanzados para 7 días de crecimiento, fueron de 1g de biomasa por litro de medio de cultivo. Estos resultados fueron obtenidos con las botellas de 440 ml. Al aumentar la escala, baja la producción (0,7 g/l para 5 litros y 0,6 g/l para 25 litros) debido a que al aumentar el volumen la intensidad de iluminación disminuye por aumento de la longitud de paso y por sombreado de las mismas algas. La concentración de xantofilas obtenida para las mejores condiciones de crecimiento fue de 1 mg de xantófilas por g biomasa. De los métodos estudiados para la ruptura de la pared celular el que dio mejores resultados fue el mortero Se logró aislar y cultivar en laboratorio un alga nativa que puede ser utilizada para la producción de xantófilas. Se obtuvieron concentraciones de biomasa de algas y de xantófilas comparables con las citadas en la bibliografía para producción.