GENERACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS CLAUDIA MACHICADO RIVERO, Ph.D. Asesora científica de F. Hoffmann-La Roche peru.diagnostico_molecular@roche.com

Herramientas y métodos bioinformáticos RESUMEN RESUMEN Introducción Herramientas y métodos bioinformáticos Diseño de cavidades en el interior de proteínas Acoplamiento molecular proteína-ligando Screening masivo y automático de librerías de fármacos

Creación de sitios de unión INTRODUCCIÓN Creación de sitios de unión + -Estabilizar proteínas -Modular la actividad (interruptor) -Albergar y vehiculizar fármacos

Nos centramos en el interior (mejor definido) Estrategia para el diseño de sitios de unión y vehiculización de ligandos in vivo 1) Construcción del sitio de unión de ligando Nos centramos en el interior (mejor definido) ¿COMO METER UN LIGANDO EN UNA PROTEINA DETERMINADA? Elegimos una proteína modelo y creamos agujeros virtuales. Seleccionamos los que no colapsan. Hacemos acoplamiento masivo de bases de datos de ligandos a los agujeros. Comprobamos que el ligando seleccionado se une al mutante con agujero.

2) Vehiculización Modificamos la proteína para que se localice en un tipo celular o en un orgánulo determinado

1. Elegir residuos grandes e hidrófobos enterrados en la proteína. Diseño de proteínas terapéuticas 1. Elegir residuos grandes e hidrófobos enterrados en la proteína.

2. Mutaciones truncantes Diseño de proteínas terapéuticas 2. Mutaciones truncantes

3. Creación de una cavidad Diseño de proteínas terapéuticas 3. Creación de una cavidad

4. Estudio de la unión de pequeñas moléculas Diseño de proteínas terapéuticas 4. Estudio de la unión de pequeñas moléculas

Esquema general del trabajo

Estabilidad y plegamiento Flavodoxina de Anabæna como modelo de estudio + Holoproteína FMN Apoproteína Trp 57 Tyr 94 Dominio de unión a FMN FMN Clonada Estabilidad y plegamiento Cristalizada

Herramientas y métodos bioinformáticos Proteína Cavidad Software InsightII (Accelrys Inc.) Diseño in silico de cavidad Ligando Complejo modelado 2. Docking Flexible+Screening masivo y automático 3. Evaluación energética Programas varios: Linux Software Affinity + Catalyst (Accelrys Inc.)

Objetivos Desarrollar un procedimiento teórico de diseño de proteínas portadoras que eventualmente puedan emplearse en el campo de la Medicina. Diseñar proteínas con cavidad: analizar su estructura y estabilidad y evaluar su capacidad de unir moléculas específicas. Determinar teóricamente la afinidad y complementariedad de las cavidades creadas por pequeñas moléculas orgánicas. Seleccionar y evaluar automáticamente la energética de los ligandos más prometedores de unirse en una cavidad, partiendo de una librería de miles de compuestos. Comprobar experimentalmente la fiabilidad de los métodos bioinformáticos desarrollados.

 PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD  PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO  CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS

Diseño de un método para predecir la formación de cavidades en proteínas Modelos de estudio: Mutantes truncadas Lisozima T4 Barnasa Citocromo c peroxidasa Mutaciones truncantes in silico Minimización de energía Análisis de los modelos: dimensiones de la cavidad y estructura global

Modelización de proteínas con cavidad Ampliación Reducción 19 mutantes de lisozima T4 3 mutantes barnasa 2 mutantes cit. c perox.

Predicción del porcentaje de reducción de la cavidad Steepest descents Conjugate gradients Steepest descents reprodujo con mayor precisión el porcentaje de reducción de las cavidades: ligeros cambios en la estructura

Predicción de la estructura de las proteínas con cavidad Expansión Teórico Cristal Modelo Bajos valores de rmsd entre la estructura cristalizada y modelada Alta precisión en la predicción de la forma y tamaño de las cavidades y de la estructura global de la proteína Reducción Teórico Cristal Modelo

Diseño de cavidades en el núcleo hidrófobo de la flavodoxina de Anabæna Trp66 Leu44 Ile52 Ile109 Leu105 Mutaciones in silico truncantes a Ala (Phe) Método de modelización Análisis de los modelos de flavodoxina con cavidad

Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad * modelos sobre la holoflavodoxina Flexibilidad reducida del núcleo hidrófobo Muy ligeros rearreglos en la estructura de la proteína Ningún colapso fue observado

Mutantes modeladas de flavodoxina de Anabæna con cavidad W66F/L105A W66F/L44A Cavidad: 185 Å3 Cavidad: 204 Å3 Machicado C., Bueno M. & Sancho J. 2002. Predicting the structure of protein cavities created by mutation. Protein Engineering. 2002 Aug;15(8):669-75.

Estudio experimental del plegamiento de las mutantes de flavodoxina con cavidad Dicroísmo circular en el UV-lejano Dicroísmo circular en el UV-cercano La creación de cavidades fue crítica para 2 mutantes (I109A y W66F/I109A): parcialmente desplegadas

Proteína Tm (K  EE) Tm (K) Estudio experimental de la estabilidad térmica de las mutantes de flavodoxina con cavidad FLUORESCENCIA Tm (K  EE) Tm (K) CD EN EL UV-LEJANO -1.8 -10.2 -10.9 -22.3 -25.2 Proteína Tm (K  EE) Tm (K) Silvestre W66F -3.7 W66F/L105A -10.6 W66F/L44A -9.3 I109A -15.3 W66F/I109A -21.3 La creación de cavidades generó una importante desestabilización térmica en todas las mutantes: Pérdida de contactos de vdw Pérdida de la fuerza hidrófoba

Método de modelización de cavidades aplicado a otras proteínas: anti-HBsAg scFv fragment Pedroso I, Irun MP, Machicado C, Sancho J. Biochemistry. 2002 Aug 6;41(31):9873-84.

Método de modelización de cavidades aplicado a otras proteínas: COX-I Rebeca Acın-Perez, Marıa Pilar Bayona-Bafaluy{, Marta Bueno, Claudia Machicado, Patricio Fernandez-Silva, Acisclo Pe´rez-Martos, Julio Montoya, M.J. Lo´pez-Perez, Javier Sancho and Jose´ Antonio Enrıquez* Hum Mol Genet. 2003 Feb 1;12(3):329-39.

Método de modelización de cavidades aplicado a otras proteínas: receptor de LDL C. Machicado, S. Castillo, M. Bueno, M. Pocoví y J. Sancho. Clin Invest Arterioscl 2003;15(2):59-65

 PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD  PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO  CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS A CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS

Implementación de un método para modelar complejos proteína-ligando Lisozima L99A + 17 ligandos 23 moléculas no unidoras Estructuras cristalizadas (9) DGunión experimentales (15)

El método de docking molecular debe reproducir la unión proteína-ligando Unión Proteína-Proteína Unión Proteína-Ligando Entropía Entalpía Desolvatación Efecto hidrofóbico

Simulaciones computacionales de la unión proteína-ligando Algoritmo de acoplamiento 1. Explora conformaciones que favorezcan la interacción proteína-ligando 2. Minimiza la energía potencial de los complejos. 3. Ordena conformaciones de acuerdo a la energía obtenida.

Etapas del acoplamiento molecular proteína-ligando 1. Acoplamiento flexible Monte Carlo y minimización de energía, en un campo de fuerza CVFF 30 conformaciones distintas Selección de complejos: Metropolis 2. Evaluación de la energía potencial de los complejos y elección del más estable 3. Energía libre de unión teórica de los ligandos ∆Gunión= ∆GPL + ∆GP + ∆GL + ∆Gdesol

Variables definidas Sitio de unión: residuos en la superficie de la cavidad Átomos flexibles: Sitio de unión (cavidad) y ligando Átomos rígidos: Resto de proteína FLEXIBILIDAD DEL SITIO CUADRÍCULAS DE DOCKING Campo de fuerza: CVFF Dimensiones de la cuadrícula Método de minimización y número de pasos Prueba de selección Temperatura de Metrópolis CÁLCULOS ENERGÉTICOS SIMULACIÓN (5-6 HORAS) 30 CONFÓRMEROS PARA CADA LIGANDO ELECCIÓN DEL MEJOR CONFÓRMERO

Predicción de la estructura de complejos Lisozima L99A-ligandos Cristal Modelo Complejos modelados son casi idénticos a los cristalizados Método de acoplamiento reproduce con alta precisión la estructura de los complejos proteína-ligando

DISCRIMINACIÓN DE LIGANDOS QUE NO SE UNEN Benzofurano (UNIÓN) Ácido benzoico (NO UNIÓN) Claudia Machicado, Jon López-Llano, Santiago Cuesta- Bueno & Javier Sancho. Journal of Computer-Aided Molecular Design (2005) 19 (6):

Predicción de la unión moléculas a la Lisozima L99A 1. Éxito en el 74 % de casos de moléculas no afines a la cavidad: POCOS CASOS DE FALSOS POSITIVOS 2. Unión del 100% de los ligandos verdaderos de la cavidad: NO HUBIERON FALSOS NEGATIVOS

Cambio de la energía libre durante la unión de una proteína y un ligando DG = DH -TDS Las moléculas de agua aumentan su entropía (efecto hidrófobo) Aparecen interacciones entre la proteína y el ligando Proteína y ligando pierden grados de libertad

PARAMETRIZACIÓN DE LA ENERGÉTICA Gu = H - TS Gu = Hsu + HI + HI:p - TSI - TSw - TSp - TSpl - Hl:w

unión de un complejo proteína-ligando Implementación de una ecuación para calcular el cambio de energía libre de unión de un complejo proteína-ligando ∆Gunión = ∆Htotal - T∆Sconf - T∆SW ∆Gunión = ∆GP +∆GL+ ∆GPL+ ∆Gdesol

CAMBIO DE ENTROPÍA DEL AGUA (Sw) CAMBIO DE ENTROPÍA CONFORMACIONAL DEL LIGANDO (Sl) Y LA PROTEÍNA (dSp) Novotny et al., 1987 Krystek et al., 1993 -TS = 0,52N * 298 kcal mol-1 CAMBIO DE ENTROPÍA DEL AGUA (Sw) Luque & Freire, 2000 -TSw = 0,45(ASAnp) * ln(T/384.15) - 0.26(ASAp) * ln(T/335.15) * 298 cal K-1 mol-1 ENTROPÍA TRASLACIONAL Y ROTACIONAL (Spl) Krystek et al., 1993 -TSPL = 11 kcal mol-1

Ecuación 2 Ecuación 1 Predicción del cambio de energía libre de unión de los complejos proteína-ligando Grupo de entrenamiento: 6 complejos Parametrización del DGu experimental (15) con datos teóricos ∆Gu = 0.07∆GP + 0.28∆GL + 0.19∆GPL + 1.64∆Gdesol Ecuación 2 Ecuación 1 ∆Gu = 0.18∆Htotal - 0.02T∆Sconf - 0.8T∆Sw Grupo de entrenamiento Otros complejos Grupo de entrenamiento Otros complejos

RESULTADOS: CÁLCULO DE Gu EN LOS CONTROLES NEGATIVOS LIGANDOS QUE QUEDAN FUERA DE LA PROTEÍNA DESPUÉS DEL DOCKING MOLECULAR

 PREDICCIÓN DE CAVIDADES EN EL INTERIOR DE PROTEÍNAS: DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES DE FLAVODOXINA CON CAVIDAD  PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA Y ENERGÍA DE UNIÓN DE COMPLEJOS PROTEÍNA-LIGANDO  CRIBADO MASIVO DE LIGANDOS EN CAVIDADES DE PROTEÍNAS Y DETECCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS PREDICHOS

Método de cribado virtual de bibliotecas de ligandos en cavidades de proteínas NCI-DB 250251 moléculas Filtros de polaridad Filtro de volumen (I) CATALYST y VEGA (Awk) ACOPLAMIENTO INICIAL (II) CERIUS2 Puntuación y lista de candidatos ACOPLAMIENTO FINO (III) AFFINITY Evaluación del Gu Ligandos potenciales

Cribado masivo de la NCI-DB frente a la lisozima L99A: Enriquecimiento de la lista de candidatos CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO* 1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51 1. Filtros iniciales Volumen SASp Lipolo 2. Consensus score 1.5 3824 65 3. SumScore 0.17 469 534 SumScore = 0.1(vdW + LS2 + 0.3*BuryPol2 + 1.5*Cpol) + 0.2(PLP1 + PLP2 + Jain + PMF) NO UNIDORES U NIDORES 2. Consensus Score Ligandos que puntuan bien considerando 5 funciones de energía 3. Puntuación global Sumatoria de 8 funciones de energía (SumScore) NºLigEnc*NºBD NºLigTot*NºCandidatos *TE=

Búsqueda de ligandos de la flavodoxina mutante con cavidad W66F/L44A 2% de NCI-DB Holoflavodoxina mutante W66F/L44A Acoplamiento masivo y puntutación CRITERIO DE % DE LA NCI-DB Nº LIGANDOS TASA DE SELECCIÓN ENRIQUECIMIENTO 1. Volumen/polaridad 2.0 4913 51 2. Consensus score 1.4 3690 68 3. SumScore 0.2 585 428 Acoplamiento fino y cálculo del Gu 9 ligandos con gran afinidad por la cavidad 3 moléculas poco afines a la cavidad

Complejos modelados flavodoxina W66F/L44A-ligando y energía de unión del complejo LIGANDO PUESTO EN Gu (Kcal mol-1) LA LISTA UNIDORES Bencilamina 66 -7.4 Piridina 324 -7.6 Benceno 355 -8.4 Furano 435 -6.6 Tolueno 585 -8.3 NO UNIDORES Butanol 2312 -3.0 Colina 2803 N.a.ii 2-fenil-propanol N.a.i -3.5 N.a.i Fue excluido con el Consensus Scoring N.a.ii Salió expelida de la cavidad luego del docking

Detección experimental de la unión flavodoxina-ligando: Medición de la Tm UNIDORES PREDICHOS NO UNIDORES PREDICHOS COMPUESTOS DDTm ± EE Bencilamina 2,20 ± 0,82 Benceno 2,20 ± 0,56 Furano 1,90 ± 0,66 Piridina 1,60 ± 0,47 Tolueno 1,05 ± 0,60 COMPUESTOS DDTm ± EE Butanol 0,60 ± 0,48 Colina -0,75 ± 0,42 2-fenilpropanol 0,60 ± 0,61

Detección experimental de la unión flavodoxina W66F/L44A-ligando: Titulaciones del ligando Bencilamina DG = -2.8 kcal mol-1 Benceno DG = -2.0 kcal mol-1 Furano DG = -1.8 kcal mol-1

FUTUROS ESTUDIOS

APLICACIÓN BIOMÉDICA: VEHICULIZACIÓN DE FÁRMACOS Selección compuestos candidatos Cribado virtual a gran escala COLECCIONES DE COMPUESTOS Bibliotecas de compuestos existentes Química combinatorial Productos naturales GENÓMICA Identificación del blanco Validación del blanco Cribado experimental a gran escala (HTS) Selección y optimización de compuestos cabecera Diseño del fármaco Ensayos celulares Candidato a pruebas clínicas

? ? ? ? ? APLICACIÓN BIOMÉDICA: ENSAYOS CELULARES CON PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE LIGANDOS Transporte plasmático ? Especifidad ? Ingreso ? Liberación ? Acción intracelular ?