Epidemiología molecular de las infecciones por STEC Detección y caracterización de Escherichia coli productor de toxina Shiga en alimentos Epidemiología molecular de las infecciones por STEC Bioq. Isabel Chinen Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

DEFINICION DE EHEC / STEC Cepas de E. coli productor de toxina Shiga (STEC) que producen enfermedades severas en el hombre pertenecen a la categoría de E. coli enterohemorrágico (EHEC) EHEC es un subgrupo dentro de los STEC Factores de virulencia en cepas EHEC: Toxina Shiga (Stx1, Stx2, variantes de Stx1 y Stx2) Factores de adherencia: Isla de patogenicidad (LEE) Enterohemolisina (EHEC-Hly) Humanos: > 150 serotipos; 50 serotipos asociados a SUH Animales, alimentos, otros reservorios: > 200 serotipos

MANIFESTACIONES DE LA INFECCION POR Escherichia coli PRODUCTOR DE TOXINA SHIGA   Portación asintomática Diarrea acuosa Diarrea sanguinolenta Colitis hemorrágica Síndrome Urémico Hemolítico Aunque la diarrea se autolimita en 1 semana, 5 – 10% de los pacientes evolucionan a SUH

SINDROME UREMICO HEMOLITICO Anemia hemolítica microangiopática Insuficiencia renal aguda Trombocitopenia Tasa de letalidad del 2 al 5%

VIGILANCIA DE SUH Y DIARREAS ASOCIADAS A STEC Tipos de Estrategias Notificación obligatoria, inmediata e individualizada en Planilla C2 al SNVS. Abril 2000 - Resolución N°346/00 Vigilancia Centinela: Unidades Centinela con SUH como EVENTO TRAZADOR DE ETA: 24 UC - 16 Jurisdicciones. Ciudad de Buenos Aires (3), Córdoba, Corrientes, Chaco, Chubut, Entre Ríos, La Pampa, Mendoza, Neuquén, Pcia. de Buenos Aires (5), Río Negro, Salta, San Juan, Santa Fé (3), Tucumán, S. del Estero Sistema de Vigilancia de Laboratorios (SIVILA) Vigilancia molecular (PulseNet de América Latina y El Caribe) Programa de Enfermedades Emergentes – OPS - Países del Conosur y Centroamérica.

SUH - ARGENTINA 2007 Incidencia No. of Cases 5.0 7.6 4.1 3.4 2.5 10.2 25.7 19.2 14.0 38.0 24.7 - 5 >5 10 >10 20 34.4 9.6 4.1 31.6 22.2 9.7 0.9 10.2 12.8 3.4 105.2 2.5 5.0 No. of Cases Incidencia 15/100,000 niños <5 años No. of Cases >20

SUH EN ARGENTINA Alrededor de 300 a 400 casos nuevos por año Tasa de notificación: 15 / 100.000 niños < 5 años, mas de 10.000 desde 1965 Pródromos: Diarrea 90%, sanguinolenta 75% 1ª causa pediátrica de IRA y 2ª causa de IRC Responsable del 20% de transplantes renales Evidencia de infección por STEC en el 40% de casos de SUH - O157:H7 el serotipo prevalente - Shigella dysenteriae Tipo 1 no aislada

STEC O157:H7

CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO El 11 de mayo de 2004, se incluyó en el Código Alimentario Argentino el art. 156 tris y se modificaron los art. 255 y 302. Especificaciones microbiológicas Productos preparados a base de carne picada una vez cocidos: ausencia de E. coli/g y ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65 g cada una Carne picada fresca y chacinados frescos: E. coli máximo 5 x 102 UFC/g, y ausencia de E. coli O157:H7/NM en 5 muestras de 65g cada una. Metodología recomendada es la validada por USDA/FSIS.

Características de E. coli O157:H7 Posee la mayoría de las características bioquímicas de la especie, con las siguientes diferencias: No fermenta el Sorbitol o lo hace lentamente No posee actividad de b-glucuronidasa Temperatura óptima de crecimiento: 30-42ºC Desarrolla pobremente a 44-45ºC No desarrolla a temperaturas superiores a 45ºC No desarrolla a temperaturas de –10ºC pero sobrevive en productos congelados (-20ºC) sin cambio en el número total de microorganismos por períodos prolongados Es resistente a los cambios de pH (por Ej. Durante la fermentación de embutidos

CRITERIOS PARA LA DETECCIÓN DE STEC O157 MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS EN MEDIO SELECTIVO DETECCION DEL SEROGRUPO O157 CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS DISTINTIVAS DETECCION DE LA ENTEROHEMOLISINA DETECCION DE GENES (stx) PRODUCCION DE TOXINA SHIGA (Stx)

DETECCION DE STEC O157 EN ALIMENTOS CONSIDERACIONES GENERALES TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO BAJO NUMERO DE UFC EN ALIMENTOS BAJA DOSIS INFECTIVA (< 100 UFC/G)

Detección, aislamiento e identificación de Escherichia coli O157:H7 de productos cárnicos USDA / FSIS (2008) ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TAMIZAJE AISLAMIENTO ( - ) ( + ) - AISLAMIENTO MEDIOS SELECTIVOS SEPARACION INMUNOMAGNETICA Positivo potencial - SEROAGRUPAMIENTO Positivo presuntivo CONFIRMACIÓN PRODUCCION DE Stx / DETECCIÓN DE GENES stx DETECCIÓN DE fliCH7 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA Positivo confirmado

ETAPA DE ENRIQUECIMIENTO CONDICIONES DE INCUBACION - TEMPERATURA Y TIEMPO 42 ± 0.1ºC / 15-22 h - SIN AGITACION MEDIOS DE CULTIVO (suplemento antibiótico) - ECm + novobiocina - CTS + acriflavina - CTSm + casaminoácidos + novobiocina - CTS / AP + vancomicina, cefsulodina y cefixima

De acuerdo a USDA/FSIS deben cumplimentar: TECNICA DE TAMIZAJE O157 De acuerdo a USDA/FSIS deben cumplimentar: Sensibilidad: 98% Falsos negativos:  2% Especificidad:  90% Falsos positivos:  10% Eficiencia:  94% Servicio Fisiopatogenia (LNR) INEI-ANLIS “Dr. C.G. Malbrán”

Tamizaje. Métodos Rápidos Detección de STEC O157 Tamizaje. Métodos Rápidos ELISA Test de inmunocromatografía Métodos automatizados Premier - Meridian TECRA Inmunostat Card - Meridian REVEAL - Neogen RapidCheck O157- SDI Singlepath GLISA - Merck Lateral Flow System - Dupont Vidas ICE/ACE - Bio Mérieux PCR Real Time NucliSens - Bio Mérieux

Detección, aislamiento e identificación de Escherichia coli O157:H7 de productos cárnicos USDA / FSIS (2008) ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TAMIZAJE AISLAMIENTO ( - ) ( + ) - AISLAMIENTO MEDIOS SELECTIVOS SEPARACION INMUNOMAGNETICA Positivo potencial - SEROAGRUPAMIENTO Positivo presuntivo CONFIRMACIÓN PRODUCCION DE Stx / DETECCIÓN DE GENES stx DETECCIÓN DE fliCH7 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA Positivo confirmado

AISLAMIENTO DE STEC Procedimiento de diagnóstico definitivo Métodos de cultivo Cultivo directo en medios selectivos Cultivo con enriquecimiento previo Métodos de inmunoconcentración Separación inmunomagnética (Dynal, Neogen) Inmunocaptura (TECRA) miniVIDAS: método automatizado

MEDIOS DE CULTIVO - STEC O157:H7/NM AISLAMIENTO DE STEC MEDIOS DE CULTIVO - STEC O157:H7/NM Selectivos y/o diferenciales SMAC C-SMAC CT-SMAC Agar Sangre Triptosa Cromogénicos Agar O157:H7 ID CHROMAgar O157 Fluorogénicos MUG (4-metilumberiferil-β-D-glucurónido) BCIG (5-bromo-4-cloro-3-indonil -β-D-glucurónido)

SEROAGRUPAMIENTO Aglutinación directa en lámina - Antisueros anti-O157 (Difco, INPB) - Reactivos de látex (OXOID)

Detección, aislamiento e identificación de Escherichia coli O157:H7 de productos cárnicos USDA / FSIS (2008) ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TAMIZAJE AISLAMIENTO ( - ) ( + ) - AISLAMIENTO MEDIOS SELECTIVOS SEPARACION INMUNOMAGNETICA Positivo potencial - SEROAGRUPAMIENTO Positivo presuntivo CONFIRMACIÓN PRODUCCION DE Stx / DETECCIÓN DE GENES stx DETECCIÓN DE fliCH7 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA Positivo confirmado

Detección, aislamiento e identificación de Escherichia coli O157:H7 en productos cárnicos USDA / FSIS (2008) CONFIRMACIÓN IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA SEROTIPIFICACIÓN CONFIRMATORIA O157:H7 Al menos uno de los siguientes criterios: PRODUCCION DE Stx DETECCIÓN DE GENES stx DETECCIÓN DE fliCH7

CONFIRMACION DE STEC Detección de STX Detección de genes stx - Citotoxicidad en células Vero Métodos inmunológicos ELISA Meridian Test de inmunocromatografía Merck RPLA Denka Seiken Detección de genes stx Hibridación PCR

Detección, aislamiento e identificación de Escherichia coli O157:H7 de productos cárnicos USDA / FSIS (2008) ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO TAMIZAJE AISLAMIENTO ( - ) ( + ) - AISLAMIENTO MEDIOS SELECTIVOS SEPARACION INMUNOMAGNETICA Positivo potencial - SEROAGRUPAMIENTO Positivo presuntivo CONFIRMACIÓN PRODUCCION DE Stx / DETECCIÓN DE GENES stx DETECCIÓN DE fliCH7 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA Positivo confirmado

STEC no-O157

DETECCION DE STEC no-O157 EN ALIMENTOS CONSIDERACIONES GENERALES PREVALENCIA DE STEC no-O157 EXISTEN > 200 SEROTIPOS DESCRIPTOS NO PRESENTA CARACTERÍSTICAS DISTINTIVAS CRITERIO DE DETECCIÓN DETECCION DE GENES (stx) PRODUCCION DE TOXINA SHIGA (Stx)

Enriquecimiento de la muestra Aislamiento e identificación de STEC no-O157 a partir de muestras de alimento Enriquecimiento de la muestra 65g de alimento + 585 ml Caldo Ec Tratamiento en “Stomacher” durante 3 minutos Incubación a 37ºC - 18 hs Tamizaje por PCR MK+IAC Templado: 1 ml de caldo enriquecido 150 ul de tritón/1% TE) - PCR MK (+) ( -) Aislamiento - Siembra en placas EMB Levine Incubación a 37ºC – 18 hs. Confirmación - Identificación de la colonia STEC+ por PCR múltiple Identificación bioquímica Seroagrupamiento por aglutinación en placa y PCR Caracterización de los factores de virulencia eae/ehxA/saa por PCR

Tamizaje PCR MK + IAC PCR MK para detección de stx Primer Secuencia del primer (5’-3’) Nº de nucleótidos Tamaño del fragmento de amplificación (pb) MK 1 TTTACGATAGACTTCTCGAC 20 224 o 227 MK 2 CACATATAAATTATTTCGCTC 21 Reactivo Concentración de trabajo del reactivo Concentración del reactivo en la mezcla Volumen del reactivo en la mezcla para una determinación (l) Buffer 10X 1X 5 Mezcla dNTP 2,5 mM 0,1 mM 2 Cl2Mg 50 mM 1,5 mM 1.5 Primer MK 1 0,1 nmol/l 2 pmol/l 0,5 Primer MK 2 Taq polimerasa 5 U/l 0,02 U/l 0,2 Templado IAC 0,2UFC/ l Agua Trid. estéril 38,3 Volumen Final 50

PCR MK + IAC para la detección de stx1 y stx2 de Escherichia coli 1 2 3 4 5 (+) (-) cs M 100 pb 300 pb 200 pb Leotta y col. Enviado a Int. J. Food Microbiol. 2006

PCR MK para la detección de los genes stx1 y stx2 E. coli O157:NM stx1/stx2 E. coli O145:NM stx2 Carne con aditivo Carne sin aditivo Carne con aditivo Carne sin aditivo 1 10 102 103 1 10 102 103 1 10 102 103 1 10 102 103 + - s/t M E. coli ONT:H19 stx1 E. coli O26:H11 stx1 Carne con aditivo Carne sin aditivo Carne con aditivo Carne sin aditivo 0,01 0,1 1 10 0,01 0,1 1 10 0,1 1 10 102 0,1 1 10 102 + - s/t M

STEC O157 y no-O157 DE ORIGEN HUMANO. 1999-2007 CEPAS STEC ORIGEN O157 Nº (%) no-O157 SUH 371 (42,1) 148 (58,3) DS 209 (23,8) 26 (10,2) D 184 (20,9) 51 (20,1) OTROS 116 (13,2) 29 (11,4) TOTAL 880 254

STEC SEROTIPOS N = 1134 O157:H7 76% O8:H19 0,3% O145:NM 10% O113:H21 0,3% O26:H11 2% O145:H25 0,3% O111:NM 0,8% O171:H2 0,3% O174:H21 0,8% O8:H16 0,2% O103:H2 0,6% O15:H27 0,2% O91:H21 0,4% O174:H28 0,2%

STEC O157 y no-O157 DE ALIMENTOS 2003-2007 STEC no-O157 STEC Totales 49 (42,1) 167 (58,3) 216 (100) Hamburguesas, carne vacuna, carne picada, carne de cerdo, embutidos. > 30 serotipos diferentes Asociados a casos humanos O157:H7 O113:H21 O8:H19 O91:21 O103:H2 O174:H21

Genotipificación de Stx STEC O157 STEC no-O157 Food Food

eae / ehxA de cepas STEC aisladas de humanos y alimentos 75% 3% 9% 13% Humanos 14% 5% 29% 52% Alimentos

Fagotipos de STEC O157

EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR EN TIEMPO REAL PFGE Protocolos de CDC para PulseNet 24-h Enzimas : XbaI and AvrII/BlnI Cepa de referencia: S. Braenderup CDC#H9812 Programa informático: BioNumerics Ver. 4.6 (Applied Maths) 2007 Bases de Datos 1988-2008 STEC O157 Nº de cepas: 1207 Nº de patrones XbaI-PFGE: 524 Patrones prevalentes XbaI-PFGE (17%) AREXHX01.0011 (118 cepas) AREXHX01.0022 (83 cepas) STEC no-O157 Nº de cepas: 450 Nº de patrones XbaI-PFGE: 315 Patrones prevalentes XbaI-PFGE (7%) AREXSX01.006 (15 strains) AREXSX01.0124 (14 strains) Confirmación de brotes Detección de “Clusters” Brotes difusos

RELACION CLONAL DE CEPAS DE E RELACION CLONAL DE CEPAS DE E. coli O157 PERTENECIENTES A UN BROTE EN LA COMUNIDAD NEUQUEN Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%] PFGE-XbaI PFGE-XbaI Nº Cepa XbaI-PFGE Genotipo Fagotipo Caso Edad Sexo Lugar Código de Brote Stx 100 95 90 247/07 AREXHX01.0200 . Stx2only 4 BD 2- 3 F SM Andes 07NQEXH-3 255/07 AREXHX01.0200 . Stx2only 4 BD 3- 11 M SM Andes 07NQEXH-3 254/07 AREXHX01.0200 . stx2 only 4 HUS 3- 6 M SM Andes 07NQEXH-3 246/07 AREXHX01.0440 . Stx2only 4 BD 1- 3 M SM Andes 07NQEXH-3 234/07 AREXHX01.0086 . Stx2-Stx2vh-a 2 HUS 1- 8 M Neuquén Localidad: San Martín de los Andes Barrios: El Arenal, Oasis, Centro Período: 24/02/07 al 03/03/07

Brote de E. coli O157 en un Jardín de Infantes Entre Rios, Argentina. 2004 Figura 1: confirmación mediante PFGE del Brote E. coli O157:H7 stx2 / stx2c (stx2vh-a) / eae / ehxA XbaI-PFGE AREXHX01.0243 BlnI-PFGE AREXHA26.0064 N° cepa Origen Edad Sexo Fecha de aislamiento PFGE-BlnI 100 PFGE-XbaI Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%] 63/04 64/04 65/04 99/04 SUH DS Asintomático 27/01/04 30/01/04 02/02/04 12/02/04 3 a 10 m 2 a 4 m 4 a 7m 2 años M F Figura 2: control de excreción de STEC O26:HNT E. coli O26:NT stx1 / eae / ehxA XbaI-PFGE AREXSX01.0108 BlnI-PFGE AREXSA26.0069 N° cepa Origen Fecha de Semana aislamiento epidemiológica Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%] 100 PFGE-XbaI PFGE-BlnI 106/04 ctrol 1 106/04 ctrol 2 106/04 orig Contacto 24/02/04 02/03/04 12/02/04 8/04 9/04 6/04

Brote Familiar. Neuquén – Agosto/Septiembre 2008 E. coli O157:H7 stx2 / stx2c (stx2vh-a) / eae / ehxA XbaI-PFGE AREXHX01.0331 BlnI-PFGE AREXHA26.0083 Investigación del caso: Caso: Niña de 10 meses SUH (1ºM 25/08/08 y 2ºM 30/08/08) Diarrea Sanguinolenta (3ºM 08/09/08) Grupo familiar - 3 contactos asintomáticos: padre (1ºM 11/09/08), madre (1ºM 11/09/08) y tía (1ºM 11/09/08). Seguimiento de la excreción: Caso: niña de 10 meses Asintomática 27 días luego de la 1º M (4ºM 22/09/08) Grupo familiar - 1 contacto asintomático: madre 7 días luego de la 1º M (2ºM 18/09/08). Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-98.3%] 100 PFGE-XbaI PFGE-BlnI 1 1 2ºM 2 3 3 2ºM 1* 3ºM 1* 4ºM 4 2008-08-25 2008-08-30 2008-09-11 2008-09-18 2008-09-08 2008-09-22 HUS Contacto/padre Contacto/madre asintomática Contacto/tía 0- 10 29 24 20 F M Nº TM Origen Edad (a-m) Sexo BD

RELACION CLONAL DE CEPAS DE E RELACION CLONAL DE CEPAS DE E. coli O145 PERTENECIENTES A UN BROTE FAMILIAR Caso SUH : Niña 20 meses criterios diagnósticos negativos Contacto hermana: 13 años Contacto padre: 38 años Contacto hermana: 15 años E. coli O145:NM Stx2, Int-, EHEC-Hly Contacto hermana: 4 meses Dice ( Opt :1.50%) (Tol 1.5% - 1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0% - 98.3%] PFGE - XbaI PFGE - XbaI N ° Cepa Patrón XbaI-PFGE Origen Procedencia 100 1104/06 AREXSX01.0006 Contacto/hermana Htal . Prov. Heller /Neuquén 1105/06 AREXSX01.0006 Contacto/hermana Htal . Prov. Heller /Neuquén 1106/06 AREXSX01.0006 Contacto/padre Htal . Prov. Heller /Neuquén

SUH POR CONSUMO DE HAMBURGUESAS Caso: niña de 2 años atendida en el Hospital Garrahan el 26 de abril de 2002, con diarrea sanguinolenta que evoluciona a SUH Alimento sospechoso: hamburguesas caseras consumidas 48 horas antes del inicio de la diarrea Se aisló del coprocultivo y del alimento: Escherichia coli O157:H7 eae/stx2+stx2vh-a/EHEC-hlyA, PT4 con idéntico patrón de XbaI-PFGE y BlnI-PFGE Rivas et al. EID 2003, 9: 1184-6

Comparación de patrones de PFGE de Argentina y USA XbaI pattern EXHX01.0047 BlnI pattern EXHA26.0015 ARG = pattern 1 CDC = pattern 2

(origen, lugar y fecha de toma de muestra) Relación genética de cepas STEC O157 por XbaI-PFGE. Comparación de los resultados obtenidos por técnicas de subtipificación y datos referentes a las muestras (origen, lugar y fecha de toma de muestra)

CONCLUSIONES La recuperación de cepas con idéntico patrón XbaI-PFGE, PT y genotipo stx de muestras obtenidas: En diferentes locales fuente única de contaminación En distintas fechas persistencia en la fuente de origen En muestras crudas y cocidas, falla en el proceso de y en el mismo local cocción o contaminación cruzada La recuperación de cepas con diferente patrón XbaI-PFGE, PT y En el mismo local diferentes cepas circulantes

CONCLUSIONES STEC O157 y no-O157 son detectados en enfermedad humana, en el reservorio animal y en alimentos Es importante fortalecer la vigilancia del SUH e infecciones por STEC mediante: Integracción de las diferentes áreas Implementación de metodologías sensibles de diagnóstico tanto en laboratorios clínicos como de bromatología. Implentación de PFGE en tiempo real Consolidación de la base de datos

Muchas Gracias!