Desarrollo de un inmunoanálisis para la proteína renal específica myo- inositol oxigenasa, un posible biomarcador de la lesión renal aguda J.P. Gaut, D.L. Crimmins, M.F. Ohlendorf, C.M. Lockwood, T. A. Griest, N.A. Brada, M. Hoshi, B. Sato, R.S. Hotchkiss, S. Jain y J.H. Ladenson Mayo de © Copyright 2014 by the American Association for Clinical Chemistry

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción  La lesión renal aguda (LRA) es un problema común y significativo  Afecta al 45 % de los pacientes gravemente enfermos y el 20 % de los pacientes hospitalizados, lo que causa un aumento de morbilidad y mortalidad  Incluso la LRA leve aumenta el riesgo de la insuficiencia renal crónica  El método de referencia para el diagnóstico, creatinina sérica y diuresis, es no específico e insensible  Depende de la masa muscular, la dieta y la función hepática  Puede no cambiar hasta que se haya perdido el 50 % de la función renal

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción  Se necesitan biomarcadores de LRA tempranos y confiables Dado que los cambios estructurales preceden la pérdida de las funciones en la mayoría de los casos de LRA, las proteínas estructurales puede ser más sensibles a los daños  Biomarcadores estructurales con regulación positiva después de la lesión  Molécula-1 de lesión renal, lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos, interleucina 18, inhibidor tisular de metaloproteinasas tipo 2 e insulina como factor de crecimiento de la proteína vinculante 7  Biomarcadores estructurales intrínsecos de la LRA  Fosfatasa alcalina,  -glutatión-S-transferasa,  g-glutamiltrasnpeptidasa y N-acetil-  -glucosaminidasa

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta  ¿Cuál es el biomarcador ideal de la lesión renal aguda?

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y métodos  Identificación de los genes renales específicos  Se realizó el análisis por micromatrices (Affymetrix) mediante la disección de cerebro, hígado, bazo, riñón, músculo esquelético, pulmón, corazón e intestino delgado de tres ratones C57Bl/6.  Obtuvimos estos datos para los genes con valores de diferencia media > en el riñón, expresado en aumentos > 10 veces en el riñón en relación con otros tejidos y expresado en el túbulo proximal.  Anticuerpos anti-myo-inositol oxigenasa (Anti-MIOX)  Se generaron anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón a GST-MIOX humana recombinante.  La MIOX recombinante se confirmó mediante secuenciación N-terminal de Edman.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y métodos  Inmunoanálisis de MIOX  Se desarrolló un inmunoanálisis no competitivo para MIOX mediante el uso de dos anticuerpos monoclonales murinos diferentes y se realizó la detección con un sistema de detección electroquimioluminiscente.  Se usó la GST-MIOX humana recombinante para generar curvas estándar.  Modelo murino  Se sometieron ratones C57Bl/6 de 8 a 12 semanas de vida a la isquemia renal bilateral durante 30 minutos.  Una semana antes de la cirugía se obtuvo el suero y se lo congeló a -80 °C.  Se sometió a dos animales del grupo quirúrgico de referencia a un procedimiento idéntico sin pinzamiento de pedículos vasculares.  24 h después de la cirugía, se realizó la extracción de suero y riñones.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y métodos  Pacientes humanos  Se realizó la detección de los aumentos de creatinina plasmática ocurridos durante h en pacientes adultos gravemente enfermos.  También se realizó la detección de la creatinina sérica estable durante 72 h a los pacientes.  No se incluyeron los pacientes con insuficiencia renal crónica o que no presentaran sondas de Foley.  Se obtuvieron muestras del plasma restante antes de los aumentos en la creatinina plasmática (tiempo 0) y en el momento del aumento de creatinina (tiempo 54).  Se obtuvo una muestra representativa de pacientes con creatinina estable.  Se realizó la revisión de las historias clínicas de los pacientes para obtener información demográfica, sobre diuresis y diagnóstico.  Se definió la oliguria como la diuresis < 0.5 ml/kg/h durante al menos 6 h.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta  ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del estudio de un biomarcador que utiliza las muestras restantes?

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 1. (A) Expresión de ARNm Miox en tejidos murinos. (B) Expresión de MIOX en homogeneizados tisulares humanos (50 mg proteína/carril) con un anticuerpo policlonal de ratón anti-MIOX. La proteína observada migra entre la anhidrasa carbónica (CA, 29 kDa) y la ovoalbúmina (OVA, 45 kDa). SBTI - inhibidor de la tripsina de soja (20 kDa). No se observó tinción en ausencia de un anticuerpo principal. Especificidad renal de MIOX Diferencia media (unidades de micromatriz) Cerebro Pulmón Corazón Riñón Hígado Bazo Intestino Músculo esquelético Páncreas Hígado Cerebro Pulmón Riñón Bazo Testis Ovario Corazón Páncreas

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 2. (A), Inmunoelectrotransferencia de homogeneizado de riñón humano normal (riñón) que utiliza anticuerpos policlonales de conejo (pAb R9544) y anti-MIOX monoclonales de ratón 12H06 y 1D10. La GST- MIOX se cortó con trombina, se aplicó en el mismo gel, se transfirió al PVDF y a la proteína teñida (Protein Stain). Las bandas con tinción de proteínas se sometieron a la secuenciación de Edman y se confirmó que representaban a MIOX y GST. La única banda que reaccionó con los tres anticuerpos correspondió a la MIOX recombinante ( ∼ 33 kDa). Anticuerpos Anti-MIOX Patrón Riñón Patrón Riñón Patrón Riñón GST-MIOX Patrón Tinción de proteína

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 4. (A) Se realizó la medición de Miox en suero murino en la valoración inicial y 24 horas después de la LRA (n = 5). No se detectó Miox en la valoración inicial. El valor de Miox en suero aumentó a las 24 h luego de la cirugía (2.8 ± 0.7 ng/ml; media ± SEM). *P < 0.02 (prueba de la t para datos emparejados). (B) Sección representativa de la corteza renal a las 24 h después de la lesión. La necrosis tubular extensa es evidente (flechas, H y E, 400x). No se observó necrosis tubular en animales del grupo quirúrgico de referencia. Modelo murino con LRA MIOX sérica (ng/ml) LOD Grupo quirúrgico de referencia Valoración inicial 24 h

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 5. MIOX en pacientes gravemente enfermos y hospitalizados. (A) La creatinina sérica (CrS) alcanzó el valor máximo de 54.3 ± 3.8 h (Tiempo de 54 h) en relación con la medición de CrS anterior (Tiempo de 0 h) y aumentó en el tiempo de 54 h en pacientes con LRA (**P < 0.005). (B), Los pacientes con LRA demostraron mayores concentraciones de MIOX plasmática en el tiempo 0 y el tiempo 54 en comparación con pacientes sin LRA (*P = 0.002). MIOX en pacientes humanos B MIOX plasmática (ng/dl) Sin LRA Tiempo de 0 h Tiempo de 54 h A Creatinina plasmática (mg/dl) Sin LRA Tiempo de 0 h Tiempo de 54 h

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 6. (A) La creatinina sérica es similar entre todos los grupos en el tiempo de 0 h. (B) La MIOX plasmática aumentó en el tiempo de 0 h en pacientes con LRA oligúrica y LRA que requería diálisis. * P < MIOX en pacientes humanos A Creatinina plasmática (mg/dl) Tiempo de 0 h Sin LRA LRA no oligúrica/LRA oligúrica Diálisis B MIOX plasmática (ng/dl) Tiempo de 0 h Sin LRA LRA no oligúrica LRA oligúrica Diálisis

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta  ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de MIOX como biomarcador de la lesión renal aguda?  ¿Qué preguntas adicionales sobre la biología de MIOX deben responderse?

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