MICROSCOPIA Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen Es la resolución y no el aumento la que dicta los límites que pueden ser observados. Para el M óptico los límites de resolución están en 0.2um y para el M electrónico los límites aumentan hasta 1000 veces La capacidad de aumento de un M compuesto se calcula multiplicando el aumento del objetivo por la del ocular El poder de resolución está en función de la longitud de onda de la luz y de la apertura numérica propiedad de la lente que integra el objetivo La mayoría de los microscopios tienen oculares de 10 a 15X y objetivos de 10 a 100X. Con los objetivos de 100X se usa el aceite de inmersión.

TIPOS DE MICROSCOPIOS Entre los microscopios ópticos : campo claro, contraste de fases, Normarski contraste de interferencia diferencial (DIC) , campos oscuro y fluorescencia Microscopía electrónica: de transmisión (TEM) y de barrido (SEM)

MICROSCOPIO OPTICO DE CAMPO CLARO Y OSCURO En el M de campo claro la muestra debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz Se deben usar métodos de tinción ya que el campo claro no produce contraste En el M de campo oscuro la única luz que entra en el objetivo es la dispersada por la muestra Los organismos se ven brillantes sobre fondo oscuro y es útil para estudiar la motilidad de los organismos

El contraste de fases se basa en que las células poseen diferentes índices de refracción y producen un desvío de los rayos de luz que da lugar a una imagen oscura sobre fondo brillante El contraste de interferencia diferencial (DIC) o Normarski usa dos rayos de luz polarizada y las imágenes aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado El M de fluorescencia se usa para muestras capaces de emitir fluorescencia emitiendo luz dentro del espectro visible cuando es expuesta a la luz UV DIC FLUORESCENCIA

MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Células epiteliales triple coloración: núcleo (azul), microtúbulos (verdes), actina (rojo) 200X 1000X

MICROSCOPIO ELECTRONICO Para estructuras internas se usa el TEM que usa electrones en vez de rayos de luz en cortes ultrafinos para ver ácidos nucleicos y proteínas Para mejorar el contraste se tratan con acido ósmico, lantano, uranio o plomo Para estructuras externas se usa el SEM cubriendo la muestra con una capa de oro. El haz de electrones del SEM barre la superficie y los electrones desviados son proyectados en una pantalla para producir una imagen Se pueden obtener rangos de amplificación de 15X a 100000X en la superficie de los objetos

FLUOROCROMOS DAPI Naranja de acridina Rojo Texas Ioduro de Propidio FITC Autofluorescencia Rodamina

¿Para qué el microscopio?

¿Resolución del ojo humano?

¿Resolución del ojo humano? Aproximadamente 1/10 milímetros

¿Cuál es el tamaño de una Escherichia Coli? 1x3 mm 1X3 µm 1x3 nm

¿Cuál es el tamaño de una Escherichia Coli? 1x3 mm 1X3 µm 1x3 nm

¿y de una célula animal típica?

¿y de una célula animal típica?

Morfología microscópica de microorganismos. Existen tres formas básicas: Esféricas (cocos) Bastoncitos o cilíndricas (bacilos) Helicoidales (espirilos)

La morfología bacteriana se puede observar de dos maneras En estado vivo. Muertas y coloreadas

Técnicas de tinción: Los colorantes se clasifican en: Básicos o Catiónicos. (azul de metileno, safranina, cristal violeta ) Ácidos o aniónicos. (eosina, fucsina ácida y rojo congo)

Clasificación de las tinciones: Negativas. Tinta china, Nigrosina. Positivas: Simple (azul de metileno) Diferenciales (Tinción de Gram) Estructurales (capsulas, esporas ,flagelos)

Tinción de Gram 1884 Cristian Gram Es una tinción diferencial Diferencia Gram+ de Gram -.

PASOS DE UNA TINCIÓN TINCIÓN DE GRAM Hacer el extendido y dejar secar Fijar la muestra con metanol o calor por flameado Agregar cristal violeta y esperar 1 min, todas las células se teñirán de color azul púrpura Enjuagar con agua Agregar lugol (I2 / IK) y esperar entre 30 seg y 3 min Agregar acetona/ alcohol y esperar entre 15-20seg Tinción de contraste con safranina o fuscina básica , esperar 1-2 min

Tinción de Gram Bacterias de Escherichia coli (Gram negativas) Bacterias de Clostridium perfringens (Gram positivas)

Gram + / Gram -

Otras Tinciones: Tinción de ácido-resistencia: Detecta bacterias acido resistentes saprófitas (Mycobacterium tuberculosis) (fucsina fenicada) Tinción de esporas/ Schaeffer y Fulton: Bacillus y Clostridium (verde de malaquita)