La Técnica histológica Es el conjunto de procedimientos que se realizan en el laboratorio para el estudio de la estructura del material biológico, desde el punto de vista microscópico.

Finalidad del estudio microscópico Conocimiento de la estructura del organismo para comprender los procesos bioquímicos y fisiológicos que en él tienen lugar. Diagnóstico de procesos patológicos.

Histológica Técnica Organismo Material de estudio Otros Fijación Inclusión Congelación Corte Tinción Montaje Observación

Finalidad de la Fijación Material de estudio Detiene la dinámica funcional y los procesos enzimáticos del organismo. Evita los procesos de autolisis (degradación por enzimas propios) y putrefacción (degradación bacteriana). Conservar las estructuras de la manera más fidedigna posible al estado vivo. Modifica la reactividad de los tejidos a los colorantes. Protege de efectos traumáticos y evita la retracción de los tejidos. Fijación Inclusión Corte Tinción Montaje Observación

Tipos de fijadores Físicos: Químicos: Calor. Aldehídos. Mercurio. Alcoholes. Agentes oxidantes. Ácido pícrico y derivados.

Moléculas objeto de la fijación Proteínas. Grasas. Hidratos de carbono.

Fijación de proteínas Coagulación: Alcohol. Actúa extrayendo la capa de agua y como consecuencia precipitan las proteínas. Desnaturalización: calor, agentes oxidantes. Consiste en un cambio de la conformación de la proteína. Reticularización: Aldehídos. Forma puentes cruzados con las proteínas, adquiriendo éstas una configuración rígida.

Fijación de lípidos Tiene lugar a través de una cambio de la constitución química de las moléculas. Se basa en un endurecimiento, con lo cual se vuelven menos solubles. Esto se consigue mediante: Oxidación específica de lípidos. Formación de sales insolubles.

Fijación de hidratos de carbono La fijación de hidratos de carbono es difícil. La mayoría de los procedimientos se basan en reacciones de precipitación, pero cuando los tejidos se introducen en otros líquidos, los hidratos de carbono se vuelven solubles. Es por ello que hay que evitar que permanezcan durante mucho tiempo en soluciones acuosas.

Fijadores químicos más utilizados M. óptica M. electrónica Paraformaldehido. Glutaraldehido. Tetróxido de osmio. Formol

Características de una buena fijación Rapidez. Penetración. Volumen de fijador. Tiempo de fijación. Presión osmótica. pH óptimo. Temperatura. Manipulación adecuada. Tamaño de la pieza.

Rapidez Es importante que transcurra el mínimo tiempo posible entre la muerte del animal y la fijación. Hay que evitar que el tejido se seque para evitar artefactos. Depende del tamaño de la pieza.

Fijación por inmersión Se introduce la pieza en un recipiente que contiene el fijador.

Fijación por perfusión Se introduce el fijador en el árbol vascular del animal vivo y anestesiado. El tiempo que transcurre entre la muerte y la fijación es mínimo. Es el mejor método para fijar tejido nervioso y muestras para Microscopía electrónica.

Penetración del fijador Depende de la difusibilidad de cada fijador individual, la cual es constante para cada uno de ellos. Para evitar este problema se puede cortar la pieza en secciones de 2 a 3 mm. Los más rápidos son el formol y el alcohol. El más lento el glutaraldehido.

Volumen del fijador Debe estar en una proporción de al menos 10:1 entre fijador y tejido. Si esto no se puede conseguir, se puede solucionar el problema cambiando el fijador a de terminados intervalos. La agitación mejora la penetración del fijador.

Tiempo de fijación No deben permanecer los tejidos en el fijador durante mucho tiempo. Para Microscopía óptica, un tiempo adecuado puede ser entre 24 horas y algunos días. En Microscopía electrónica, 12-18 horas es suficiente.

pH óptimo Se debe utilizar el fijador a un pH neutro, en el rango de 6 a 8, para lo cual se tampona el fijador, con un buffer a pH 7.

Temperatura El aumento de la temperatura favorece las reacciones químicas de autolisis, y también incrementa la velocidad de la fijación. Para evitar la autolisis se puede realizar la fijación a 4ºC.

Osmolaridad Es importante la concentración del fijador teniendo en cuenta la osmolaridad de los tejidos, con el fin de que no se produzca ni retracción ni hinchazón de los mismos. Para ajustar la osmolaridad del fijador se suele emplear sacarosa.

Preparación para microtomía Material de estudio Fijación Inclusión Congelación. Inclusión. Congelación Corte Tinción Montaje Observación

Congelación En caso de que sea necesario un diagnóstico rápido de un proceso patológico. Realización de inmunocitoquímica. La pieza se corta en un criostato

Congelación Para evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación se realiza una crioprotección mediante inmersión del tejido en sacarosa al 30 % antes de la misma. Las piezas deben congelarse rápidamente por inmersión en isopentano sumergido a su vez en nitrógeno líquido (-195 °C).

Inclusión Consiste en sustituir el agua de los tejidos por otra sustancia líquida que penetra en el tejido y los rodea. Así, los tejidos se endurecen para formar un bloque sólido que pueda ser cortado.

Inclusión Lavado. Deshidratación. Diafanización. Infiltración. Confección bloque. Autotecnicón

Lavado Se realiza para retirar el exceso del fijador, ya que éste puede tener un efecto nocivo impidiendo el buen desarrollo de la inclusión o de la coloración. Estos inconvenientes se pueden eludir lavando las piezas después de la fijación con el tampón en el cual ha sido preparado el fijador.

Deshidratación Como el tejido fijado se halla en solución acuosa y el medio de inclusión no es soluble en agua, no puede ser infiltrado directamente con el agente de inclusión. Por ello se deshidrata en una serie de alcoholes crecientes desde el alcohol de 70% al de 100% en que se elimina totalmente el agua del tejido. Con ella se endurecen las piezas.

Diafanización o aclaramiento Consiste en la eliminación del agente de deshidratación con una sustancia miscible en el agente de inclusión. Microscopía óptica Microscopía electrónica Xilol Óxido de Propileno

Medios de inclusión Parafina. M. óptica Celodina. Metacrilato. Lowicryl. Epon. Araldita. M. electrónica

Infiltración Finalmente, el tejido es infiltrado en el agente de inclusión.

Resumen del proceso de inclusión

Medios de inclusión: resinas Los agentes inclusores más utilizados en microscopia electrónica son la Araldita y el Epon. Polimerizan en la estufa a 60 °C en 48 horas. Metacrilato. Lowicryl: polimeriza a bajas temperaturas (-20ºC o con luz UV), por lo que se utiliza cuando el tejido no puede someterse a altas temperaturas.

Medios de inclusión: Parafina Son químicamente cadenas de hidrocarburos saturadas de entre 22 a 28 átomos de carbono. Sus puntos de fusión dependen de la longitud de la cadena; cuanto más larga, mayor será su punto de fusión. Las parafinas utilizadas en la técnica histológica poseen puntos de fusión entre 45 y 60 °C.

Confección del bloque Microscopía óptica: enfriamiento. M. electrónica: polimerización.

Corte Material de estudio Los tejidos deben ser cortados en finas secciones que serándepositadas sobre la superficie de un portaobjetos. El grosor de la sección dependerá del tipo de microtomo elegido, según el microscopio en el que se vaya a observar. Fijación Inclusión Congelación Corte Tinción Montaje Observación

Tipos de micrótomos Micrótomo de parafina: 7-10 micras. Criostato: 7-10 micras. M. de congelación: 10-25 micras. Vibratomo: secciones gruesas de 50 micras. Ultramicrotomo:secciones semifinas de 1 micra y secciones ultrafinas de 60-90 nanometros para observar en microscopía electrónica de transmisión.

Corte para microscopía óptica Los cortes se recogen en portaobjetos para su observación en el microscopio óptico.

Corte de secciones incluidas en parafina Las secciones se dejan flotar en un baño de agua caliente a 37ºC, que elimina las posibles arrugas. A continuación se recogen en un portaobjetos.

Corte por congelación Los cortes realizados en un criostato (todo el proceso se realiza en una cámara a -20ºC), o en un micrótomo de congelación. Se recogen directamente en un portaobjetos.

Corte en ultra micrótomo Los cortes se recogen en rejillas metálicas que sirven de soporte para su observación en el microscopio electrónico.

Tinción Para lograr contraste suficiente entre los distintos componentes de las células y poderlos diferenciar con el microscopio óptico, se emplean diversos colorantes. Cuando un componente absorbe abundante colorante, aumenta la densidad óptica y disminuye la amplitud de las ondas luminosas que lo atraviesan. Tiene aspecto más oscuro que los componentes que absorben poco colorante. El colorante absorbido imparte su color a la luz que sale del componente que lo absorbió. Material de estudio Fijación Inclusión Corte Tinción Montaje Observación

Tinción Utiliza varios colorantes con diferente capacidad para teñir diversos componentes celulares. Es necesario desparafinar e hidratar los cortes invirtiendo el orden de la inclusión en parafina.

Montaje Material de estudio Fijación La sección teñida debe cubrirse con un cubreobjetos para proteger el tejido y poderlo observar durante años. Inclusión Corte Tinción Montaje Observación

Montaje Previamente a la colocación del cubreobjetos se cubre con una resina inmiscible en agua. Ejemplos: Eukitt. Bálsamo de Canadá. Permount. Entellán.