Generación de trombina en sangre completa controlada con un ensayo basado en trombograma automatizado calibrado M. Ninivaggi, R. Apitz-Castro, Y. Dargaud, B. de Laat, H.C. Hemker y T. Lindhout Agosto de 2012 www.clinchem.org/cgi/content/article/58/8/1252.full © Copyright 2012 by the American Association for Clinical Chemistry

Introducción Una interacción equilibrada entre vasculatura, células sanguíneas y proteínas de plasma previene hemorragia por un lado y trombosis por el otro Hemostasis: no sangrado no trombosis

Introducción (cont.) Las células sanguíneas y proteínas de plasma interaccionan en una complicada red de circuitos de retroalimentación positiva y negativa para generar trombina (F IIa) FXI FXIa FIX FIXa FVIII FVIIIa FX FXa FVa FV Protrombina Fibrinógeno Fibrina TF FVII TF:FVII TF:FVIIa Trombina Ref: Tanaka KA et al. Blood coagulation: hemostasis and thrombin regulation (Coagulación sanguínea: hemostasis y regulación de trombina). Anest Analg. 2009;108:1433-46

Introducción (cont.) La trombina es una proteasa de múltiples funciones Juega un papel crucial en la hemostasis: más trombina, menos hemorragia pero más trombosis; menos trombina más hemorragia pero menos trombosis. También tiene otras funciones “no hemostáticas”. Ensayo de trombograma calibrado automatizado (CAT) Proporciona evaluación cuantitativa de formación de trombina en plaquetas ricas y pobres de plasma. Puede distinguir entre estados hipo e hipercoagulable. Trombosis tiempo Trombina Normal Hemorragia Ref: Tripodi A. The long-awaited whole-blood thrombin generation test (La nueva generación de pruebas de generación de trombina en sangre completa,grandemente esperada). Clin Chem 2012; 58: xxx-xxx.

Introducción (cont.) El ensayo CAT 1. La trombina se une al sustrato que después emite fluorescencia II IIa ZGGR-AMC AMC* 2. La concentración de trombina se calcula de la fluorescencia que desarrolla Thrombin= Trombina Peak height= Altura del pico Lag time= Desfase

Pregunta ¿Qué es lo que hace que el ensayo CAT sea superior a las pruebas convencionales tales como el PT y aPTT?

Introducción (cont.) ¿Porqué realizar ensayos de generación de trombina (TG) en sangre completa? Es más cercano a la fisiología Hay menos manipulación en el laboratorio (no centrifugación, lo que reduce los errores experimentales y tiempo requerido para realizar el estudio) Posibilidad de realizar medición directa de sangre sin anticoagulante (pinchazo en el dedo) Impedimentos para realizar el ensayo CAT con sangre completa La señal fluorescente del sustrato escindido es templada por la hemoglobina Los sedimentos de glóbulos rojos, se agrupan y retraen con el coágulo formado, lo que produce señales altamente erráticas.

Introducción (cont.) Ensayo (WB) CAT basado en sangre completa Para superar los problemas de realizar ensayos TG en WB, se hicieron las siguientes adaptaciones: - El uso de sustrato de trombina basado en rodamina en el que la excitación y emisión de longitudes de onda son menos afectadas por la hemoglobina que en un sustrato basado en AMC. - El uso de un filtro de papel poroso para crear una capa delgada de sangre, lo que da como resultado la compresión de glóbulos rojos.

Materiales & métodos Sangre completa (WB) sumergida en citrato 5µl de sangre activada (50% de WB + 50% reactivos) TG: 0.3mM P2Rho, 0.5pM factor tisular (TF), 16.7mM CaCl2 Calibración: 0.3mM P2Rho, 100nM calibrador 40µl de aceite mineral 40µl aceite Papel flitro con 5µl de muestra Papel flitro Papel filtro + muestra Papel flitro + muestra + aceite

Resultados No hay consumo de sustrato ni en efecto del filtro interior Fig. 1 En donde: Time (min)=Tiempo en minutos Fluorescence intensity (AU) = Intensidad de Fluorescencia Figura 1. Perfiles de reacción. A) Los trazos de fluorescencia que muestran la respuesta del sistema WB-CAT para TG en PPP activado y sangre completa(línea discontinua) y sangre completa (línea sólida). B) Trazos de fluorescencia de la respuesta de reacción (línea punteada, n = 3) con la desviación estándar (líneas sólidas) entre sustrato P2Rho y α2M-calibrador de trombina. La línea punteada es la primera derivativa de la pendiente del calibrador.

Resultados (cont.) Figura 2. Trombograma típico. Fig. 2 En donde: Fluorescence intensity (AU) = Intensidad de fluorescencia (AU) Thrombin (nmol/L) = Trombina (nmol/L) Time (min) = Tiempo en minutos Figura 2. Trombograma típico. La línea punteada representa los datos sin procesar de TG, la línea discontinua con sustracción de la actividad α2M de trombina y la línea sólida es la curva TG (primera derivativa de la línea discontinua) Ref: Wagenvoord R et al. The limits of simulation of the clotting system (Los límites de simulación del sistema de coagulación). J Thromb Haemost 2006;4:1331-8.

Resultados (cont.) Recomendamos realizar el ensayo con una concentración baja de TF para incluir la contribución de la vía intrínseca. La precisión intra e interensayo de la elevación del pico es suficiente para una útil aplicación del ensayo WB-CAT (respectivamente, 6.5% y 10.7% para pico de trombina) Tabla 1. Dependencia de TF recombinante de los parámetros del WB-CATa TF, pmol/L ETP, nmol · min/L LT, min TP, nmol/L TTP, min 678 (29) 8.1 (1.2) 87 (5) 12.9 (0.6) 0.5 627 (14) 4.8 (0.1) 148 (5) 6.9 (0.1) 1.0 710 (53) 4.2 (0.2) 168 (19) 6.3 (0.2) 2.0 691 (118) 3.3 (0.1) 176 (10) 5.1 (0.3) 5.0 701 (15) 2.2 (0.1) 177 (9) 4.2 (0.1) a Los datos son la media (SD) (N = 3). Tabla 1. Dependencia del factor tisular. Los parámetros del trombograma como función de la concentración del factor tisular. ETP, potencial endógeno de trombina; LT, desfase; TP, pico de trombina; TTP, tiempo del pico.

Resultados (cont.) No hay necesidad de agregar vesículas de fosfolípidos (PV) para TG en WB Los fosfolípidos procoagulantes son proporcionados por glóbulos rojos B Fig. 3 En donde: Thrombin (nmol/L) = Trombina (nmol/L) Time (min) = Tiempo en minutos Figura 3. Dependencia de fosfolípidos (A) TG en sangre completa (WB) con y sin la adición de vesículas de fosfolípidos (PV). (B) Dependencia de hematocrito

Resultados (cont.) El ensayo WB-CAT es sensible a la concentración del FVIII, que es una de los factores determinantes más importantes para la generación de trombina Fig. 4 En donde: Thrombin peak (nmol/L) = Pico de Trombina (nmol/L) Figura 4. Dependencia del factor VIII. Correlación entre los parámetros del trombograma de sangre completa ETP (A) y el pico de trombina (B) con concentraciones de plasma FVIII de pacientes con hemofilia A.

Conclusión Desarrollamos ún método que mide de manera precisa la TG en WB con el uso de una delgada capa de sangre en una placavde microtitulación con múltiples pocillos. Pregunta: El uso de papel filtro requiere ciertas precauciones. ¿Cuáles son ellas? Pregunta: ¿Qué trabajo posterior tendrá que realizarse para que el WB-CAT sea aplicable en la práctica clínica?

Diapositiva editorial La tan esperada prueba de generación de trombina en sangre completa (TGT) La TGT es más adecuada que las pruebas tradicionales de coagulación (PT y APTT) para evaluar el equilibrio pro y anticuagulante en la operación in vivo. Hasta hace poco tiempo la TGT se realizaba en plaquetas pobres o ricas en plasma. Ninivaggi et al (Clin Chem, 2012), ahora describen una nueva TGT que puede ser realizada en sangre completa, por tanto se reproducen mucho mejor que la TGT previa que ocurre in vivo.

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