MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDE Zamai et al. Apoptosis 9:235-246, 2004

ERITROPOYESIS Stem cells  células eritroides tempranas y tardías  eritrocitos Diferenciación eritroide: -  sensibilidad a EPO -  Glicoforina A -  CD45 - cambios nucleares - pérdida organelas - síntesis Hb

ANTECEDENTES Médula ósea normal  eritroblastos apoptóticos Eritroblastos inmaduros  receptores de muerte (Fas, TRAIL-R1 y TRAIL-R2) Eritroblastos maduros, macrófagos y células NK inmaduras  ligandos FasL y TRAIL Homeostasis  balance EPO vs. TRAIL y FasL

OBJETIVO Caracterizar la muerte de células eritroides que ocurre in vitro MÉTODOS Sangre  células mononucleares  CD34+  cultivo en medio sin suero (+ SCF + EPO + IL-3) Diferenciación unilinaje  población homogénea de células

CITOMETRIA DE FLUJO Ag de membrana (CD34, CD45, Glicoforina A) - Ag intracelulares (HbA y HbF) Características apoptóticas / Ciclo celular: Anexina-V Coloración supravital con IP FSC – SSC EtOH permeabilización + IP

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)  características ultraestructurales Electroforesis de ADN (ladder)  fragmentación del ADN Microscopía de fluorescencia  TUNEL marcación de 0H 3’ (dUTP-FITC)

CITOMETRIA DE FLUJO: (seguimiento de la diferenciación) Gli+ (low-int)  % Gli+ (intenso)  FSC  SSC  % Gli+ (intenso)  FSC  SSC (tamaño) (complejidad)

Citometría de flujo: detección de HbF y HbA Tinción con bencidina 20-25% Citometría de flujo: detección de HbF y HbA 80%

Microscopía electrónica de transmisión de células eritroides

Citometría de flujo: expresión de CD45 Tinción con May-Grünwald-Giensa R1 = eritroide R2 = mieloide temprana + blastos R3 = mieloide tardía + neutrófilos R4 = monocitos R5 = células muertas

CITOMETRIA DE FLUJO: Glicoforina A vs. Anexina-V-FITC Gli débil/Anx-V+ Gli neg / Anx-V+  Gli débil/Anx-V+  Gli débil/Anx-V+

Microscopía electrónica de transmisión de células apoptóticas

Citometría de flujo: ciclo celular Ladder de ADN

Microscopía de fluorescencia: Reacción TUNEL

DISCUSIÓN Diferenciación asociada con apoptosis Células eritroides tienen particular tendencia a apoptosis (característica intrínseca?) Progenitores eritroides con distinta sensitividad a EPO

DIFERENCIACIÓN ERITROIDE  Glicoforina A Hemoglobina adulta Tamaño Complejidad Material granular  Hemoglobina APOPTOSIS Anx-V+ Alteraciones nucleares Pico subdiploide Fragmentación ADN Hipótesis: apoptosis se induce en el estadio del eritroblasto basófilo

CONCLUSIÓN El incremento paralelo de células apoptóticas y células eritroides maduras, sugiere que la interacción entre eritroblastos inmaduros y maduros (donde los últimos pueden ejercer una actividad citotóxica sobre los primeros) contribuye a inducir apoptosis durante la diferenciación eritroide in vitro. Este proceso podría representar una reproducción del feedback regulatorio negativo observado en las islas eritroblásticas de la médula ósea.