Curso análisis de semen según los criterios de la OMS-2010 (2ª parte) Mariam Cortés Tormo R2 Análisis clínicos

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción Viscosidad Apariencia Volumen pH ¿ Qué hacemos con la muestra recogida? Identificar la muestra Introducirla en estufa 37ºC Si es posible someter a rotación con un agitador orbital Iniciar la observación preferiblemente a los 30 min Nunca después de 1 h.

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción Viscosidad Apariencia Volumen pH La licuefacción se ensaya visualizando la muestra Una muestra normal es una muestra licuada y homogénea Tras la eyaculación el semen es una muestra semisólida coagulada A los pocos minutos comienza a licuarse y a homogeneizarse ¿Qué pasa sí encontramos hilos de moco y cuerpos gelatinosos? Sin importancia clínica Dificultan el análisis Intentar eliminarlos a la hora de manipular la muestra para las diferentes pruebas

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción Ocurre, normalmente, dentro de los primeros 15min. a Tª ambiente Si en 60min. no ha licuado hay que reseñarlo Si hay dudas sobre la licuefacción, se puede observar al microscopio Típica imagen de una muestra no licuada Manchas que recuerdan acúmulos de grasa

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción ¿ Qué ocurre si no licua a los 60 min.? Hay que licuarla Evitar la formación de burbujas para no alterar la muestra

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción Viscosidad Apariencia Volumen pH Ensayo de la viscosidad: Con pipeta pasteur, dejando caer la muestra gota a gota Introduciendo varilla de vidrio en la muestra

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Viscosidad Una muestra con viscosidad es homogénea. No confundir con licuefacción Alta viscosidad interfiere con las determinaciones de movilidad, concentración, anticuerpos antiespermatozoide y bioquímica Se elimina igual que en el caso de no licuefacción

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción Viscosidad Apariencia Volumen pH Un semen normal debería ser homogéneo, gris opalescente

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción Viscosidad Apariencia Volumen pH Mediante pesada: Densidad = 1 Masa= Volumen Pesar el recipiente (con etiqueta)= A Pesar el recipiente con el semen = B (B – A) = nº gramos = nº ml Recipientes de recogida graduados: Medida directa del volumen No medir el volumen mediante transferencia a pipetas, jeringas o probetas, etc La transferencia da lugar a mayores errores que con métodos anteriores

Análisis de semen Evaluación inicial macroscópica Licuefacción Viscosidad Apariencia Volumen pH Refleja el balance entre las diferentes secreciones, principalmente entre el pH alcalino de las vesículas seminales y el ácido de la próstata Usar tiras 6.0-10 Chequear el color antes de 30 sg Chequear las tiras reactivas con soluciones patrón de pH Límite inferior de referencia = 7.2 pH < 7.0 + oligo/azoospermia + volumen bajo Sugiere agenesia u obstrucción de vesículas seminales y/o conductos deferentes

Análisis de semen Evaluación inicial microscópica Microscopio de contraste de fases (se aconseja atemperado a 37 ºC Observación a 100x (10x10) Agregaciones Aglutinaciones Células no espermáticas Observación a 200x-400x (10x20; 10x40) Estimación de la dilución para calcular la concentración espermática Movilidad espermática

Análisis de semen Evaluación inicial microscópica

Análisis de semen Evaluación inicial microscópica Muestra a 37º C Homogeneizar bien la muestra: Ideal utilizar agitador orbital Aspirar la muestra 10 veces con pipeta de plástico de 1,5 mm diámetro Una falta de homogeneización provocará:

Análisis de semen Evaluación inicial microscópica Agregaciones Adherencia de espermatozoides (inmóviles o móviles) a células no espermáticas o detritos Son no específicas. Ninguna significación clínica

Análisis de semen Evaluación inicial microscópica Aglutinaciones Espermatozoides móviles unidos a otros spz. Móviles Son específicas. Pueden tener significación clínica No son evidencia suficiente para deducir presencia de Ac antiespermatozoides, pero sí nos sugieren investigar su presencia

Análisis de semen Evaluación inicial microscópica Células no espermáticas

Análisis de semen Movilidad Clasificación PR: espermatozoides con movimiento progresivo, bien lineal o círculos amplios , independientemente de la velocidad

Análisis de semen Movilidad Protocolo Contar al menos 5 campos/porta Contar al menos 200 spz/porta Hacer doble contaje

Análisis de semen Movilidad Evaluación de resultados Se utiliza la gráfica del intervalo de confianza del 95% para diferencias entre dos porcentajes Es el máximo error esperado entre dos contajes en el 95% de los casos cuando el único error es atribuible al contaje Sí es >, preparar y contar 2 nuevas preparaciones de la muestra

Análisis de semen Movilidad Evaluación de resultados Ejemplo: Muestra (x2) en porta 400x IM : 1º =38 ; 2º =50 Supera la diferencia máxima admisible que está alrededor de 9

Análisis de semen Movilidad Evaluación de resultados

Análisis de semen Concentración Observación previa Dilución según observación Contaje en cámara por duplicado Evaluar resultados Cálculo final de la concentración

Análisis de semen Concentración Observación previa

Análisis de semen Concentración Observación previa Dilución según observación Contaje en cámara por duplicado Evaluar resultados Cálculo final de la concentración Material necesario: Pipetas de desplazamiento directo Pipetas automáticas normales, de desplazamiento por aire Medio de dilución Weigman

Análisis de semen Concentración Dilución según observación

Análisis de semen Concentración Observación previa Dilución según observación Contaje en cámara por duplicado Evaluar resultados Cálculo final de la concentración Cámaras de recuento recomendadas: Hemocitómetro (100 μm de profundidad) Muestras fijadas Cámaras de recuento NO recomendadas: Cámaras de pequeño volumen= pocos spz Cámaras llenadas por capilaridad= llenado desigual Muestras no fijadas= spz móviles

Análisis de semen Concentración Contaje en cámara por duplicado

Análisis de semen Concentración Contaje en cámara por duplicado Empezar a contar en la rejilla 5 hasta 200 spz Contar filas completas Si en una fila no llegamos a 200 spz seguir por la otra fila Si en mitad de una fila llegamos a 200 spz hay que seguir contando hasta acabar la fila Si con la 5 no completamos los 200 spz seguimos por la 4 y luego por la 6 Cuando se hace la dilución ½ hay que contar todas las rejillas

Análisis de semen Concentración Contaje en cámara por duplicado

Análisis de semen Concentración Observación previa Dilución según observación Contaje en cámara por duplicado Evaluar resultados Cálculo final de la concentración Si la diferencia entre los dos contajes supera el límite permitido habrá que empezar desde el principio, preparar dos nuevas diluciones y realizar de nuevo el doble contaje

Análisis de semen Concentración Observación previa Dilución según observación Contaje en cámara por duplicado Evaluar resultados Cálculo final de la concentración

Análisis de semen Concentración Valores límite y su IC 95%

Análisis de semen Concentración Cámara Makler Fácil de usar Se carga con 10μl de semen Se cuenta toda la cuadrícula el resultado divido entre 10 es la concentración en millón/ml Se evalúa a la vez concentración y movilidad ¿Por qué la OMS no aconseja su uso? Volumen bajo (profundidad 10 μm) Mayor dificultad movimiento spz Menos exacto en concentración Dificultad para fijar el cubre Mayor riesgo de error Estandarización Control de calidad

Análisis de semen Morfología Protocolo Muestras por duplicado Limpiar vigorosamente los portas con papel e identificar

Análisis de semen Morfología Protocolo

Análisis de semen Morfología Protocolo Tinciones

Análisis de semen Morfología Protocolo Tinción Diff-Quik Observación en 100x (inmersión) Contar al menos 200spz Muestras por duplicado

Análisis de semen Morfología Clasificación

Análisis de semen Morfología Clasificación No se cuentan ni los flagelos ni las cabezas sueltas v

Análisis de semen Morfología Evaluación de resultados Si el error es mayor, no es necesario volver a repetir las preparaciones pero sí el contaje El límite inferior de referencia en este nuevo manual es del 4%, a diferencia del 15 % del manual anterior

Análisis de semen Vitalidad Fundamento Es una medida indirecta del estado de la membrana plasmática Espermatozoide intacto = membrana intacta Espermatozoide muerto = membrana dañada Debe realizarse rutinariamente en todas las muestras Es importante cuando la movilidad progresiva es < 40%

Análisis de semen Vitalidad Fundamento No existe un alto grado de correlación entre Test colorantes y Test hipoosmóticos ya que miden efectos característicos distintos de la membrana plasmática

Análisis de semen Vitalidad Fundamento colorantes

Análisis de semen Vitalidad Eosina

Análisis de semen Vitalidad Eosina/Nigrosina Mejor contraste de la imagen Permite guardar y reevaluar la muestra

Análisis de semen Vitalidad Imágenes de la coloración Si sólo se tiñe la zona del cuello o la cabeza tiene una ligera coloración rosa se considerará el spz como vivo

Análisis de semen Vitalidad Fundamento hipoosmótico

Análisis de semen Vitalidad Asociación de las dos técnicas Miden estado funcional de la membrana plasmática Miden el estado estructural de la membrana plasmática

Análisis de semen Vitalidad Evaluación de resultados El límite inferior de referencia en este nuevo manual es de 58% a diferencia del 75% del manual anterior

Análisis de semen Vitalidad Utilidad evaluación resultados movilidad descartar problemas recogida muestra sdme kartagener

Análisis de semen Anticuerpos antiespermatozoide

Análisis de semen Anticuerpos antiespermatozoide El nuevo manual de la OMS: Sigue manteniendo la obligatoriedad de realizar el estudio de AAE en todos los seminogramas Es importante su realización en movilidad baja o presencia de aglutinaciones No siempre que hay aglutinaciones hay AAE Se considera que existe un factor inmunológico cuando más del 50% de los spz móviles de un eyaculado presentan AAE En casos positivos se estudiará: Isotipos presentes Intensidad de la respuesta Localización Ac Encontrar Ac no implica necesariamente facto inmunológico. Realizar pruebas funcionales

Análisis de semen Anticuerpos antiespermatozoide

Análisis de semen Anticuerpos antiespermatozoide MAR test directo Emplea semen completo Test rápido, fácil y sensible Menor información que IBT Muestras de menos movilidad que IBT Permite detectar IgG e IgA de origen secretor

Análisis de semen Anticuerpos antiespermatozoide MAR test directo

Análisis de semen Anticuerpos antiespermatozoide IB test directo Matriz poliacrilamida Emplea semen lavado Detecta IgG como IgA tanto de origen secretor como no secretor Más información al no interferir el líquido seminal

Análisis de semen Otras células Un número alto de estas células puede ser debido a: Procesos inflamatorios Alguna patología o alteración testicular

Análisis de semen Otras células

Análisis de semen Otras células Células espermatogénesis inmaduras

Fin segunda parte