Utilización de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) para el diagnóstico de Clamidia y Gonorrea. Victor N. Torres Álvarez, BS Tania N. Pérez Del Río, BS Vilmarie Figueroa Nieves, BS Katian Meléndez González, BS

Objetivos Dar una breve explicación sobre clamidia y gonorrea, su patología y los métodos tradicionales de diagnóstico. Presentar técnicas alternas para el diagnóstico eficiente de clamidia y gonorrea. NAAT Mostrar técnicas automatizadas para el diagnóstico de clamidia y gonorrea, tomando como base la técnica de amplificación de ácidos nucleídos

Introducción Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae: Bacterias comúnmente conocida por causar enfermedades de transmisión sexual (ETS) que afectan a mujeres y hombre. Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae

Chlamydia trachomatis Introducción: 30% ♀ con infecciones no tratadas C. trachomatis desarrollados enfermedad inflamatoria pélvica (PID) Si no se trata, el 20% de los que tienen PID sintomático podría llegar a ser estériles. 18% experimentará dolor pélvico debilitante y crónica. 9% tendrá un embarazo ectópico en peligro la vida Chlamydia trachomatis (sintomas)

Chlamydia trachomatis Introducción: Chlamydia trachomatis ♀ Infecciones durante el embarazo puede ocasionar al infante conjuntivitis, neumonía y endometritis posparto materna. Neumonía Conjuntivitis

Chlamydia trachomatis Introducción: Chlamydia trachomatis ♀ Infecciones durante el embarazo puede ocasionar al infante conjuntivitis, neumonía y endometritis posparto materna. En ♂ la uretritis es la enfermedad más común que resulta de la infección. Las complicaciones (por ejemplo, epididimitis) afectan a una minoría de hombres infectados y rara vez resultan en secuelas de salud reproductiva. Epididimitis Uretritis

Chlamydia trachomatis Introducción Chlamydia trachomatis Infección rectal son típicamente asintomáticos pero pueden progresar a proctocolitis.

Chlamydia trachomatis Introducción Chlamydia trachomatis Artritis reactiva adquirida sexualmente también se ha reportado como una posible consecuencia de la infección.

Tienden a causar una respuesta inflamatoria fuerte que C. trachomatis. Introducción: Neisseria gonorrhoeae Tienden a causar una respuesta inflamatoria fuerte que C. trachomatis. ♀ típicamente asintomática con complicaciones tales como PID (inflamatoria pélvica ) ♂ infección uretrales causan uretritis con dolor al orinar, la epididimitis o infección gonocócica diseminada

Personas sexualmente activas la evaluación rutinaria de laboratorios Introducción: Recomendaciones del CDC. Personas sexualmente activas la evaluación rutinaria de laboratorios Individuos Promover la Comunicación y Educación para la prevención y tratamientos disponibles. Comunidad La Utilización de diversos procedimientos de detección más específicos para mejorar la identificación de las bacterias Laboratorios

Técnicas de Detecciٴón Basadas en Cultivo

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Aislamiento e identificación de Chlamydia trachomatis Swabs especial Uretra masculina Conducto cervical Almacenaje ≤4 ° C dentro de 24 horas -70 ° C > 24 horas Inócula Centrifugación en una monocapa McCoy HeLa 229 Buffalo Green Monkey Kidney Cells http://www.mysynergylab.com/resources/microbiology_collection_appendix/genprobe.aspx La muestra es recolectada por un swabs de recolección especial el cual debe tener un eje plástico o alambre o punta cytobrush. Ya que otros materiales podrían inhibir el aislamiento. Recolección de muestras para cultivo de C. trachomatis es invasivo que requiere la inserción de un hisopo de 2-3 cm en la uretra masculina o 1.2 cm en el conducto cervical seguida de dos o tres rotaciones para recoger columnar suficiente o las células epiteliales cúbicas. Después de la recogida, las muestras de cultivo deben ser almacenados en un medio de transporte apropiados, tales como tampón de fosfato de sacarosa o glutamato y transportarse a ≤4 ° C al laboratorio dentro de las 24 horas de la recogida para maximizar la recuperación de organismos viables. Si el transporte se retrasa> 24 horas, el medio de transporte que contienen las muestras pueden ser almacenadas a -70 ° C. La muestra se inocula por centrifugación en una monocapa confluente de McCoy, HeLa 229, o Buffalo green monkey kidney cells que apoyan el crecimiento de C. trachomatis. BGMK cells are Buffalo green monkey kidney cells. BGMK cells are commonly used for the isolation of Chlamydia trachomatis and Enterovirus, with an enhanced sensitivity for Coxsackie B viruses. BGMK cells are actually kidney cells from African green monkeys; there is no species named Buffalo green monkey. For more information regarding BGMK cells, please see the following reference:

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Cultivo para C. trachomatis Método varía entre Laboratorios Prueba diagnóstica más sensible para la infección por clamidia hasta la introducción de NAAT. Sensibilidad baja prolonga el tiempo de entrega. Desventajas: Labor Complejidad Transporte Costoso Métodos de cultivo celular varían entre los laboratorios, lo que resulta en la variación sustancial en el rendimiento entre laboratorios. A pesar de las dificultades técnicas, cultivo celular, cuando es realizó por un analista experimentado, fue la prueba diagnóstica más sensible para la infección por clamidia hasta la introducción de NAAT. las desventajas en el cultivo celular de C. trachomatis. Son Debido a La sensibilidad relativamente baja, prolonga el tiempo de entrega de la prueba, las dificultades en la estandarización, la labor intensa, complejidad técnica, requisitos de recogida y transporte de muestras estrictas, y relativamente alto costo

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae Swab especial Eje de plástico o alambre (otro tipo podría inhibir) Insertar uretra masculina Canal endocervical Uretritis Exudado Transporte Hasta 48 horas a RT Las muestras recogidas por el cultivo de gonorrea deben obtenerse mediante el uso de hisopos con ejes de plástico o alambre. Otro material de hisopo como ejes de madera y puntas de algodón podría ser inhibitorio o tóxicos para el organismo y debe evitarse. Aunque la recolección de las células epiteliales es menos importante para la detección de cultivo de N. gonorrhoeae, el hisopos deben insertarse 2-3 cm en la uretra masculina o 1-2 cm en el canal endocervical seguido por dos o tres rotaciones. En los casos de uretritis, la recolección del exudado es suficiente para el cultivo de N. gonorrhoeae. Varios sistemas de transporte no nutritivos están disponibles, y algunos estudios sugieren que estos sistemas de transporte pueden mantener la viabilidad gonocócica hasta 48 horas en temperatura ambiente. Sin embargo, las condiciones ambientales pueden variar según la ubicación y la temporada, lo que podría afectar a la viabilidad de la gonorrea en estos sistemas de transporte; por lo tanto, podría ser necesaria la validación local adicional de las condiciones de transporte. http://www.mysynergylab.com/resources/microbiology_collection_appendix/genprobe.aspx

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Inóculado con el swab directamente al medio Requisitos nutricionales y ambientales Incuba en atmósfera enriquecida con CO2 a la mayor brevedad El medio de cultivo es inoculado con el hisopo y luego se coloca inmediatamente en una atmósfera enriquecida con CO2 para el transporte al laboratorio. Debido a N. gonorrhoeae exige requisitos nutricionales y ambientales para el crecimiento, las tasas de recuperación óptimos se logran cuando las muestras se inoculan directamente y cuando se incuba el medio de crecimiento en un entorno de aumento de CO2 a la mayor brevedad posible.

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Medios utilizados: Muestras en áreas no estériles Medios selectivos Thayer-Martin o Martin-Lewis Muestras áreas estériles Medios no selectivos Agar chocolate Medios para aislar N. gonorrhoeae Agar chocolate + agar sangre http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0001-63652005000300003 Métodos de la cultura gonocócica se han descrito en otra parte. Las muestras de sitios normalmente no estériles son inoculados en medios selectivos (por ejemplo, Thayer-Martin o Martin-Lewis) y muestras de sitios estériles son inoculados en medios no selectivo (por ejemplo, agar chocolate).   Medios de cultivo para aislar N. gonorrhoeae incluyen un medio base suplementado con agar chocolate (calentado) agar sangre de equino o bovino para apoyar el crecimiento del gonococo. \ Thayer-Martin agar (or Thayer-Martin medium) is a Mueller-Hinton agar with 5% chocolate sheep blood and antibiotics. It is used for culturing and primarily isolating pathogenic Neisseria bacteria, including Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis, as the medium inhibits the growth of most other microorganisms. When growing Neisseria meningitidis, one usually starts with a normally sterile body fluid (blood or CSF), so a plain chocolate agar is used. Thayer-Martin agar was initially developed in 1964, with an improved formulation published in 1966.

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae Características presuntivas: Aislados de muestra genitales en medios selectivos Diplococos gram– oxidasa + N. gonorrhoeae. Aislados recuperados de muestras genitales en medio selectivo Luego se le realiza tincion gram y da como resultado diplococcus- Gram-negativa y oxidasa positiva pueden ser identificados presuntamente como N. gonorrhoeae .

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Un resultado de la prueba de presunción sólo indica que es un diplococo Gram-negativas-oxidasa positiva Este, es suficiente para iniciar la terapia antimicrobiana, pero las pruebas bioquimicas adicionales se debe realizar para confirmar la identidad de un aislado como N. gonorrhoeae. (Tabla 1). Como se ven en esta tabla el cual presenta diferentes especies de Nisseria y los resultados variables en Acid from, reducción de nitrato entre otros

Diagnósticos Básicos de Bacteriología Cultivo para N. gonorrhoeae Económico Especifico Sensitivo El manejo es fastidioso Recolección, transporte, tiempo Las cefalosporinas son la única clase de antibióticos recomendados para el tratamiento de las infecciones de N. gonorrhoeae. http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/lecture15-microbio.htm Cultivo para N. gonorrhoeae es barato para llevarse a cabo a partir de los genitales y es específico y sensitivo si la muestra se recoge y transporta adecuadamente al laboratorio. Sin embargo, el manejo es fastidioso debido a los requisitos de recogida y transporte estrictos, y la confirmación puede tardar varios días desde el momento de la recogida de muestras. Las cefalosporinas son la única clase de antibióticos recomendados para el tratamiento de las infecciones de N. gonorrhoeae en CDC 2010 ETS las directrices de tratamiento La principal ventaja de aislar N. gonorrhoeae por cultivo es la capacidad para caracterizar el aislado aún más mediante pruebas susceptibilidad antimicrobiano y el análisis genético si es necesario.

Pruebas de sensibilidad a antibióticos Proporciona información limitada debido a cambios genéticos en el cromosoma Resistencia a: Penicilina Tetraciclina Espectinomicina Fluoroquinolonas Mutaciones en el DNA gyrase (gyrA) Mutaciones en la topoisomerasa (ParC) Pruebas de las alteraciones genéticas Conocer completamente Asociación con la resistencia Las pruebas para estos genes proporciona información limitada debido a cambios genéticos en el cromosoma también podrían conferir resistencia a la penicilina y la tetraciclina, además de espectinomicina y fluoroquinolonas. La Resistencia a fluoroquinlones por resultado de mutaciones en la DNA gyrase (gyrA) o la topoisomerasa (ParC) resultanran en una disminución de la penetración del fármaco y un incremento en el flujo. Prueba para alteraciones genéticas en el cromosoma requiere una comprensión completa de los mecanismos complejos y múltiples asociadas con la resistencia. La capacidad del laboratorio para el cultivo de N. gonorrhoeae y pruebas de sensibilidad a los antibióticos es fundamental para monitorear la resistencia. Estos agentes antimicrobianos ya no son los recomendados para el tratamiento N. gonorrhoeae, y por lo tanto las pruebas de sensibilidad no son necesarias para las recomendaciones del manejo clínico.

Pruebas de sensibilidad a antibióticos Prueba de sensibilidad Cepas viable para documentar los marcadores genéticos exactos Se prueba en placas de dilución Valores de concentración inhibitorias mínimas La evaluación de aislamientos de N. gonorrhoeae para sensibilidad a los antibióticos requiere cepas viables porque marcadores genéticos exactos de resistencia a los antibióticos a las terapias recomendadas no se han documentado.   Se Pruebas en placa de dilución que proporciona valores de concentración inhibitoria mínima de los antibióticos probados, pero podría ser demasiado difícil de realizar en laboratorios con capacidad limitada y bajos volúmenes de prueba.

Pruebas de sensibilidad a antibióticos Métodos más simples para susceptibilidad Difusión en disco y E-test (Epsilometer test) No son aprobados por la FDA para su uso en los Estados Unidos. Pero parecen ser susceptibles Difusión en disco y E-test son los métodos más simples para determinar la susceptibilidad de aislamientos gonocócica, aunque tiras de E-test cefixima no son aprobados por la FDA para su uso en los Estados Unidos. Los aislados que parecen ser sess susceptibles los criterios interpretación para los organismos susceptibles estan en el actual Clínica y Laboratorio estándar instituto (CLSI)   debe se sometida a CDC para la prueba de referencia utilizando el método de dilución en placa porque no hay criterios de interpretación del CLSI para la resistencia a los agentes terapéuticos recomendados por los CDC. Procedimientos para la dilución en agar y la prueba de difusión en disco

Pruebas de sensibilidad a antibióticos C. trachomatis Según el 2010 STD Treatment Guidelines Azitromicina frente a doxiciclina demostró que los tratamientos son igualmente eficaces La eritromicina puede ser menos eficaz Efectos secundarios Levofloxacino y ofloxacino son alternativas de tratamiento efectivas, mas costosas Según el reporte de cdc No existen procedimientos estándar para evaluar la susceptibilidad in vitro de C. trachomatis a los antibióticos. Se requiere más investigación para determinar la relación entre los datos in vitro y el resultado del tratamiento. Según el 2010 STD Treatment Guidelines En pruebas realizadas indican que azitromicina frente a doxiciclina para el tratamiento de la infección por clamidia genital demostró que los tratamientos fueron igualmente eficaces, la azitromicina puede ser más costo-efectiva en el tratamiento de la clamidia, ya que permite la provisión de una dosis única de tratamiento directamente observado. La eritromicina puede ser menos eficaz que la azitromicina o doxiciclina, principalmente a causa de la frecuente aparición de efectos secundarios gastrointestinales que pueden conducir al incumplimiento. El levofloxacino y ofloxacino son alternativas de tratamiento efectivas, pero son más caros y no ofrecen ninguna ventaja en el régimen de dosificación.

NAAT (Nucleic Acid Amplification Test)

NAAT Identifica secuencias de DNA o RNA especificas del organismo de interés Sensitividad Habilidad de producir una señal positiva con solo una sola copia de DNA o RNA No depende de organismos viables para la recuperación de DNA NAATs comerciales han sido aprobados para detectar ambos microorganismos a partir de: Muestras vaginales/endocervicales Muestras uretrales “First catch urine” (hombres y mujeres) Most commercial NAATs have been cleared by FDA to detect C. trachomatis and N. gonorrhoeae in vaginal and endocervical swabs from women, urethral swabs from men, and first catch urine from both men and women

NAAT

Metodos Polymerase Chain Reaction (PCR) qRT-PCR Amplificacion del 16s RNA Strand Displacement Amplification (SDA) NAATs offer greatly expanded sensitivities of detection, usually well above 90%, while maintaining very high specificity, usually ≥99%. NAATs typically detect 20%–50% more chlamydial infections than could be detected by culture or earlier nonculture tests

Strand Displacement Amplification (SDA) No basada en PCR Utiliza la polimerasa del fago phi 29 de Bacillus (Φ29 phage) Provee la capacidad de amplificar segmentos largos con una frecuencia de error minima (1 en 9000) “Random Primers” No hay la necesidad de usar un ciclador termal Mayor producto que en un PCR is a non-PCR based DNA amplification technique. This method can rapidly amplify minute amounts of DNA samples to a reasonable quantity for genomic analysis. The reaction starts by annealing random hexamer primers to the template: DNA synthesis is carried out by a high fidelity enzyme, preferentially Φ29 DNA polymerase, at a constant temperature. Compared with conventional PCR amplification techniques, MDA generates larger sized products with a lower error frequency. This method has been actively used in whole genome amplification (WGA) and is a promising method for application to single cell genome sequencing and sequencing-based genetic studies.

Strand Displacement Amplification (SDA) a | The random hexamers (represented by a blue line) bind to the denatured DNA (represented by a green line). b | The 29 DNA polymerase (represented by a blue circle) extends the primers until it reaches newly synthesized double-stranded DNA (represented by an orange line). c | The enzyme proceeds to displace the strand and continues with polymerization while primers bind to the newly synthesized DNA. d | Polymerization starts on the new strands, thereby forming a hyperbranched structure. Figure reproduced from Nature Protocols Ref. 9 © (2006) Macmillan Publishers Ltd. http://www.nature.com/nrmicro/journal/v6/n3/fig_tab/nrmicro1862_F1.html

NAAT Ventajas: Utilización es especímenes no-invasivos Por encima de 90% de sensitividad y mas de 98% de especificidad NAAT detecta de 20-50% mas infecciones causadas por clamidia que por cultivo Utilización es especímenes no-invasivos Orina Pacientes con restricciones culturales o religiosas Diagnostico confiable en pacientes sintomáticos y asintomáticos de gonorrea y clamidia Critico para el control de la enfermedad The increased sensitivity of NAATs makes them particularly suitable for screening, enabling accurate diagnosis of both symptomatic and asymptomatic gonococcal infections, which is critical to control of the disease.

NAAT Desventajas Alto Costo Requerimientos altos en control de calidad Contaminación Problemas relacionados a la secuencia Falsos positivos Secuencia podrían variar entre cepas

Identificacion de cepas resistentes a antibióticos Mecanismos moleculares de resistencia

Sistemas automatizados basados en NAAT

Abbott RealTime m2000 CT/NG Ensayo de amplificación in-vitro (PCR): C. trachomatis y N. gonorrhoeae Muestras son obtenidas con hisopos de vagina, endocervix y uretra (hombres) y/o orinas. C. trachomatis- Regiones conservadas para tipos salvajes y nuevas variantes. Plásmidos (X06707) encontrados en todos las variantes. N. gonorrhoeae- Regiones del gen Opa Opa= proteinas de superficie que se unen a celulas sistema inmune y producen la respuesta.

Roche cobas® 4800 CT/NG Detección in-vitro mediante amplificación (PCR) e hibridización de ácidos nucleícos. Se basa en los siguientes pasos: Preparación de la muestra Amplicación de las secuencias utilizando primers con biotina Hibridización de los amplicones con sondas específicas Detección de los productos hibridizados por colorimetría C. trachomatis- secuencias del plásmido (CP102, 103) y ADN cromosomal (CTMP 101,102) en muestras de orinas, endocervicales o uretras. N. gonorrhoeae- ADN bacterial (DR-9) en orinas y uretras (hombres), y endocervix. CP y CTMP son los primers de las secuencias. Dr-9 secuencia repetida en el ADN altamente especifica de gonorrea.

Cepheid Xpert® CT/NG Assay Detección mediante realtime PCR (cuantitativo). C.trachomatis – región distintiva del ADN cromosomal. N. gonorrhoeae- dos secuencias independientes de ADN. Se obtiene resultados en 90 minutos. Pasos principales: Ambos deben estar presentes para que sea un resultado final positivo. Doble secuencia- confiere doble especificidad. Se obtiene resultados en 90 minutos.

Hologic Aptima Combo 2 Assay Detección de CT/NG por amplificación mediada de transcripción (TMA) de rRNA. Muestras en hisopos, orinas o pruebas de Pap (ThinPrep). Se basa en: Liberación y aislamiento de rRNA en el medio. Amplifica regiones de 23S rRNA en CT y 16S rRNA en GC. Detección de amplicones mediante hibridización de ácidos nucleicos (sondas quimioluminiscentes). TMA- se transcribe el RNA a DNA y luego se amplifica. Parten de la premisa que el rRNA es mucho mas abundante en la celula que DNA.

BD ProbeTec ET CT/NG Utiliza la tecnología de SDA (Strand Displacement Amplification) C. trachomatis- secuencias del plásmido (7,500 pb) N. gonorrhoeae- región de gen de proteína homóloga de pili. Detección mediante transferencia de energía fluorescente (ET). Este es un sistema que da ciertos valores segun la fluorescencia detectada.

Conclusión Avances tecnológicos en el campo de diagnostico clínico han permitido el diseño de técnicas moleculares para la detección de patógenos. Esto nos permite no depender tanto en técnicas de cultivo. Además, ha permitido la disminución del tiempo requerido para la identificación de un patógeno. Ya no hay limitaciones debido a la cinética de crecimiento del organismo. Disminuye el periodo de evaluación. Por ende, pacientes pueden ser tratado con mayor efectividad y rapidez, disminuyendo la progresión de la enfermedad y de transmisión. Technological evolution in clinical laboratory diagnostics has advanced considerably by allowing for the direct molecular detection of a pathogen in a clinical specimen rather than relying on isolation and cultivation. This approach has decreased the time required to identify a pathogen because the laboratory is no longer limited by the growth kinetics of the organism. Therefore, patients can be evaluated and if infected can be treated promptly, thereby diminishing progression to disease and disrupting transmission. As with all changes in laboratory technology, a synthesis of scientific evidence is required for an informed decision regarding the implementation of a new or improved test platform. Previous CDC recommendations to use NAATs for the detection of chlamydia and gonorrhea as the standard laboratory test remain. These updated CDC recommendations now specify that vaginal swabs are the preferred specimen for screening women and include the use of rectal and oropharyngeal specimens among populations at risk for extragenital tract infections. FDA clearance is important for widespread use of a test, and it is important that clearance be obtained for NAAT use with rectal and oropharyngeal specimens, and with vaginal swabs collected in other than clinic settings.

Referencias Gaydos et al., 2004. Comparison of Three Nucleic Acid Amplification Tests for Detection of Chlamydia trachomatis in Urine Specimens. J Clin Microbiol. Jul 2004; 42(7): 3041–3045. Jaton et al/. 2006. A Novel real-time PCR to detect Chlamydia trachomatis in first-void urine or genital swabs. Journal of Medical Microbiology (2006), 55, 1667–1674 Lasken, R (2012). Genomic Sequencing of Uncultured Microorganims from Single Cells. Nature Reviews Microbiology 10, 631-640 (September 2012) Schachter et al., 2005. Confirming Positive Results of Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs) for Chlamydia trachomatis: All NAATs are not Created Equal. Journal of Clinical Micriobiology, Mar. 2005, p. 1372–1373 Walker et al., 2008. Single Cell Genomics. Nature Reviews Microbiology 6, 176-177 Whiley et al., 2006. Nucleic Acid Amplification Testing for Neisseria gonorrhoeae. J Mol Diagn. Feb 2006; 8(1): 3–15.

Referencias Guidelines for Managing Sexually Transmitted Infections. Recuperado de: http://silverbook.health.wa.gov.au/Default.asp?PublicationID=1&SectionID=54 Recommendations for the Laboratory-Based Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae — 2014. Recuperado de: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr6302a1.htm https://www.abbottmolecular.com/us/products/infectious-diseases/realtime-pcr/c-trachomatis-n-gonorrhoeae-ct-ng-assay.html http://molecular.roche.com/assays/Pages/cobas4800CTNGTest.aspx http://www.hologic.com/sites/default/files/package%20inserts/502487-IFU-PI.pdf https://www.bd.com/ds/technicalCenter/whitepapers/LR598.pdf

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