Extracción y Cuantificación de ADN

Tecnología Básica Extracción y Cuantificación Amplificación: PCR (Polymerase Chain Reaction) Separación: Electroforesis Detección Análisis

Extracción de ADN: Múltiples maneras!!

EXTRACCION DE ADN ORGANICA CHELEX PAPEL FTA OTRAS Pueden depender en Extracciones basadas en estuches QIAamp, GeneClean, etc. Pueden depender en Protocolos de LAB Tipo de muestra

Preparación de Muestra Extracción de ADN Orgánica Extracción por Chelex Extracción de ADN utilizando papel FTA Estuches QIAamp para separar ADN Equipo basados en robótica pueden requerir otros métodos

EXTRACCION ORGANICA DE ADN PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI) PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores)

EXTRACCION ORGANICA DE ADN COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K) AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos Particiona macromoléculas basedo en propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA RECUPERACION DE ADN Hay que ‘limpiar’; diferentes maneras de hacer esto

EXTRACCION POR CHELEX 1991 Laboratorios Bio-Rad RESINA QUELANTE REMUEVE MAGNESIO (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN) ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA CELULA UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)

EXTRACCION POR CHELEX AÑADA MUESTRA AL TUBO AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX 100°C PARA ROMPER CELULAS DESTRUIR PROTEINAS ADN ES DENATURADO A CADENAS SENCILLAS UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN PCR

EXTRACCION CON PAPEL FTA™ PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA CONTIENE QUIMICOS PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS

Tecnología FTA® Rompe células y membranas de organelos -Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN) Preserva y Proteje Acidos Nucleicos -Previene Daño por radicales libres/UV -Previene Daño Enzimático -Inhibe crecimiento de hongos y bacterias Provee Seguridad al Usuario -Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos

Preparación de ADN Rápida y Eficiente

FTA: Forma de Archivo Costo Efectiva Convencional versus FTA 240 Tarjetas = 240 muestras Temp de almacenaje = Temp ambiente 240 Tubos = 240 muestras* Temp de almacenaje= -200C Plates*Assumes Original Sample + 3 daughter samples 10 Platos = 240 muestras Temp de almacenaje = -200C Costo $75/gabinete de archivo Costo $2,000/congelador/año

Archivado a Temperatura Ambiente Perfil de STR de sangre archivada en 1989 y analizada en 2003 Muestras archivadas en ambientes diferentes, selladas en sobre de aluminio Proceso normal de colección de muestra 10 µL de reacciones de Profiler™ añadido a muestras, 24 ciclos

EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™ Sangre o saliva seca en papel FTA Células se ROMPEN al contacto UTILIZE “rotera” para añadir MUESTRA al TUBO LAVE para remover HEME y otros inhibidores de PCR Añada “roto” DIRECTAMENTE a reacción de PCR

EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™ CUANTIFICACIÓN NO es necesaria Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes Posible AUTOMATIZACIÓN

TRANSFER aqueous (upper) phase to new tube ORGÁNICA Papel FTA CHELEX Mancha de sangre ROTO LAVAR Múltiples veces con buffer de extracción PREPARAR PCR Reactivos de PCR SDS, DTT, EDTA y proteinase K ENCUBAR (56 oC) Phenol, chloroform, isoamyl alcohol CUANTIFICAR ADN Aplicar sangre al papel y dejar que se seque VORTEX (NO CUANTIFICACIÓN) Agua ENCUBAR (ambiente) 5% Chelex ENCUBAR (100 oC) REMOVER sobrenadante Centrifugar TRANSFER aqueous (upper) phase to new tube CONCENTRAR muestra (Centricon/Microcon-100 or ethanol precipitation) TE buffer Figure 3.1 Schematic of commonly used DNA extraction processes. Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

CUANTIFICACIÓN DE ADN ESENCIALES PARA ANÁLISIS POR PCR MUY POCO ADN CAUSA TOO DECAIMIENTO DE ALELOS O FLUCTUACIONES ESTOCÁSTICAS DEMASIADO ADN CAUSA DATA FUERA DE ESCALA MÉTODOS INICIALES NO MUY SENSITIVOS O ESPECÍFICOS ABSORBENCIA A 260 nm TINCIÓN CON BROMURO DE ETIDIO Cuantificación comparada a marcador estándar

Cuantificación por "Slot Blot" Procedimiento Común Específico para primates Ha sido modificado para utilizar quimioluminiscencia en vez de radioactivida Puede detectar cantidades menores que nanogramos Puede detectar ADN de cadena doble y cadena sencilla

CUANTIFICACIÓN DE ADN CUANTIFICACIÓN POR "SLOT BLOT" ESPECÍFICO PARA ADN HUMANO O DE PRIMATE D17Z1 RADIOACTIVO COLORIMÉTRICO QUIMIOLUMINISCENTE

CUANTIFICACIÓN DE ADN CAPTURAR ADN GENÓMICO EN MEMBRANA DE NILÓN AÑADIR PRUEBA D17Z1 INTENSIDAD DE LA MUESTRA COMPARADA A ESTÁNDARES SENSITIVA A ~ 150 pg DE ADN o 50 copias de ADN genómico

Slot Blot Ventajas Desventajas Puede ser sensitivo Reemplaza radioactividad Puede detectar cadenas sencillas y ADN parcialmente degradado. Cantidad dada es sólo de ADN humano Consume tiempo Labor intensiva

Muestras Desconocidas 20 ng 10 ng 5 ng 2.5 ng 1.25 ng 0.63 ng Estándares de Calibración Muestras Desconocidas ~2.5 ng Figure 3.3 Illustration of a human DNA quantitation result with the slot blot procedure. A serial dilution of a human DNA standard is run on either side of the slot blot membrane for comparison purposes. The quantity of each of the unknown samples is estimated by visual comparison to the calibration standards. For example, the sample indicated by the arrow is closest in appearance to the 2.5 ng standard. Figure 3.3, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Fluorometría vs Espectrofotometría

Fluorometría *Utilizar un fluorocrome como Hoechst 33258 o PicoGreen -- aumento en emisión a 458 nm cuando enlazado a ADN de doble cadena *Tiene poca afinidad para ADN de cadena sencilla o ARN --se enlaza al surco menor, rico en A-T *Muestra es comparada a curva estándar de ADN cuya concentración es conocida --utilize estándar con composición similar para lecturas más precisas

Cuantificación de ADN por espectrofotometría Concentración de ADN puede ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo Medidas tomadas a una A260 deben leer entre 0.1 y 1.0. Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 µg de ADN por ml A260 = 1 ⇒ 50 µg/ml

Pureza de ADN: Proporción A260/A280 *Proporción indica pureza/presencia de contaminantes que pueden absorber luz UV (proteínas, etc.) *ADN puro tiene una proporción de ≈ 1.7-2.0 --en buffer ligeramente alcalino, pH 7.5 *Fenol absorbe a 270-275 nm (similar a ADN) --imita alta pureza y producción --aumenta el valor A260

PCR utilizando 'Real time' (qPCR) Continuará!!