Diagnóstico por componentes en alergia alimentaria Pamplona 7-8 Mayo 2010 Diagnóstico por componentes en alergia alimentaria María Luisa Sanz Departamento de Alergología e Inmunología Clínica 1

Diagnóstico de precisión en Alergia alimentaria -Verificar los Ac IgE específicos funcionalmente relevantes Distinción: Sensibilización-Alergia Problemas reactividad cruzada: Pólen-alimento Alimento-alimento:PP!! -Identificación de las moléculas o epítopes responsables 2

Pasado y presente del diagnóstico alergológico Herramientas que han abierto nuevos horizontes en el diagnóstico de alergia alimentaria Pasado y presente del diagnóstico alergológico Harwanegg C. et al CEA 2003 3

-Diferentes proteínas de una única fuente alergénica Diagnóstico basado en componentes permite Identificar los patrones individuales de sensibilización frente a: -Diferentes proteínas de una única fuente alergénica -Proteínas homólogas en diferentes alimentos -Diferentes epítopes de una molécula alergénica Pru p 1 Pru p 3 Pru p 4 4

SAO Síntomas sistémicos Patrones diferentes de sensibilización según área geográfica Component-resolved diagnosis (CRD) Norte de Europa Pru p 1 Pru p 4 SAO Pru p 1 Pru p 3 Pru p 4 Europa mediterránea Pru p 3 Fernández-Rivas M et al. J Allergy Clin Immunol. 2003 Oct;112(4):789-95. Síntomas sistémicos Gamboa PM et al Allergy 2008 Asociación riesgo: LTP Asero 2000 5 5

-Diferentes proteínas de una única fuente alergénica Diagnóstico basado en componentes permite Identificar los patrones individuales de sensibilización frente a: -Diferentes proteínas de una única fuente alergénica -Proteínas homólogas en diferentes alimentos -Diferentes epítopes de una molécula alergénica PR-10 6

Reactividad cruzada 7

Sindromes de reactividad cruzada y componentes alergénicos Ácaros/Gamba/Caracol/Cucaracha Tropomiosina Albúmina sérica Quitinasas de clase I Profilinas, Proteínas alto peso molecular PR-10 (homólogos de bet v 1) Profilinas Vicilina Cerdo-gato Látex-frutas Artemisia-apio-zanahoria- especias Polen de abedul-alimentos (manzana, zanahoria, avellana, apio, patata) Gramíneas-melocotón Los sindromes no se entendian porque se pensaba en relaciones entre moléculas según fuentes alergénicas. 20% de los niños alérgicos a PLV, incluso ocn epitelio con carne cruda (san juan row beef dog dander) Cacahuete-guisante 8 8

-Diferentes proteínas de una única fuente alergénica Diagnóstico basado en componentes permite Identificar los patrones individuales de sensibilización frente a: -Diferentes proteínas de una única fuente alergénica -Proteínas homólogas en diferentes alimentos -Diferentes epítopes de una molécula alergénica Persistencia Gravedad... 9

SPOT μArrays μArrays-TAB Epitopos IgE en los alergenos alimentarios J.Lin, H.Sampson. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2009 10

Familias principales de alérgenos 143 familias de alérgenos que contienen 889 alérgenos http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/ 11

Familias mas importantes de alérgenos alimentarios vegetales Karin Hoffmann-Sommergruber & E. N. Clare Mills Anal Bioanal Chem (2009) 395:25–35 12

Familias mas importantes de alérgenos alimentarios animales Karin Hoffmann-Sommergruber & E. N. Clare Mills Anal Bioanal Chem (2009) 395:25–35 13

Alérgenos moleculares o componentes alergénicos Bases de datos www.allergen.org web internacional de nomenclatura de alérgenos (IUIS-WHO) www.allergome.org web sencilla, completa y con numerosos links www.ifr,ac.uk/protall base de datos de Ag alimentos. Proyecto UE 14

Panalérgeno PR-10 -Proteínas homólogas -Molécula compartida por diferentes fuentes alergénicas separadas filogenéticamente, con estructura y función similar que explican fenómenos de reactividad cruzada PR-10 Bétula, manzana, cataña... Homólogo de Bet v1 15

Panalérgeno -Proteínas homólogas -Molécula compartida por diferentes fuentes alergénicas separadas filogenéticamente, con estructura y función similar que explican fenómenos de reactividad cruzada Tropomiosina 16

Panalérgenos 17

Moléculas relacionadas con Pru p 3 Allergome Sequence Homology ring Moléculas relacionadas con Pru p 3 18

Moléculas relacionadas con Der p 10 Allergome Sequence Homology ring Moléculas relacionadas con Der p 10 19

¿Que es un microarray? Los microarrays son matrices bidimensionales de alta densidad donde se ha inmovilizado material biológico que permite la automatización simultánea de miles de ensayos en paralelo. El material inmovilizado, que se utiliza como sonda biológica, pueden ser ácidos nucleicos (Oligonucleótidos o cDNA), proteínas, (anticuerpos, enzimas, etc.), pequeñas moléculas, etc. 20

21

Primeros estudios de Microarrays aplicados a alergia con extractos alergénicos completos Detection of Multiple Allergen-specific IgEs on Microarrays by Immunoassay with Rolling Circle Amplification Steve Wiltshire, Shawn O’Malley, Jeremy Lambert, Kari Kukanskis, David Edgar, Stephen F. Kingsmore and Barry Schweitzer Clin Chem 2000 22

Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2002 Microarrayed allergen molecules: diagnostic gatekeepers for allergy treatment Reinhard Hiller, Sylvia Laffer, Christian Harwanegg, Martin Huber, Wolfgang M. Schmidt, Anna Twardosz, Bianca Barletta, Wolf M. Becker, Kurt Blaser, Heimo Breiteneder, Martin Chapman, Reto Crameri, Michael Duchêne, Fatima Ferreira, Helmut Fiebig, Karin Hoffmann-Sommergruber, Te Piao King, Tamara Kleber-Janke, Viswanath P. Kurup, Samuel B. Lehrer, Jonas Lidholm, Ulrich Müller, Carlo Pini, Gerald Reese, Otto Scheiner, Annika Scheynius, Horng-Der Shen, Susanne Spitzauer, Roland Suck, Ines Swoboda, Wayne Thomas, Raffaela Tinghino, Marianne Van Hage-Hamsten, Tuomas Virtanen, Dietrich Kraft, Manfred W. Müller, and Rudolf Valenta Presentan la nueva tecnología de microarrays para el diagnóstico en alergia tipo I Utilizan proteínas naturales purificadas o recombinantes procedentes de 35 diferentes fuentes alergénicas, que las fijan a portas preactivados mediante técnica de microarrays La mayor diferencia con otras tecnologías convencionales es que el microarray contiene las moléculas definidas de cada alérgeno como reactantes. Permite la identificación de las moléculas responsables 23

CEA 2007 VENTAJAS Miniaturización del diagnóstico alergológico Va a hacer realidad el sueño de conocer todas las especificidades de la IgE en un paciente alérgico En una editorial del CEA en 2007 Poulsen vislumbra las posibles ventajas de la miniaturización del diagnóstico alergológico 24

Diagnóstico molecular de la hipersensibilidad mediada por IgE Diagnóstico basado en componentes Microarray 25

Microarray de IgE específica Determinación semi-cuantitativa la IgE específica frente a 103 componentes alergénicos, recombinantes y naturales purificados, mediante la tecnología MICROARRAY ISAC 103 ( Phadia, Suecia). 7,5 cm 2,5 cm 26

Microarrays de proteínas para la determinación de IgE específica Matriz de componentes alergénicos en la determinación de sIgE ISU 27

Revelado.Se añade espAc MICROARRAY ISAC 103 (Immuno solid phase chip) Determinación semi-cuantitativa de la expresión de IgE específica frente a 103 proteínas purificadas y recombinantes Obtención suero Incubación muestra Revelado.Se añade espAc Wash <50 ml suero Duración: 3 hours Escanea el biochip Análisis de imagen Obtención Informe Lavado Duración: 10 min. 28

PANEL DE ALERGENOS DEL MICROARRAY ISAC 103 (Immuno solid phase chip) ISAC CDR 103 29

ISAC CRD 103 Alérgenos de origen vegetal -Marcadores especie específicos -Marcadores de reactividad cruzada Proteínas de almacenaje - Proteínas procedentes de las semillas sirviendo como materia prima durante el crecimiento de la planta. -A menudo prot estables y resistentes al calor causando reacciones en alimentos cocinados 30

ISAC CRD 103 Alérgenos de origen vegetal Proteínas PR-10 Homologos Bet v 1 • En el Norte y Centro de Europa el abedul o los pólenes relacionados son considerados los sensibilizadores más importantes causantes de síntomas respiratorios. -La presencia de proteínas PR10 en vegetales y frutas puede causar síntomas debido a reactividad cruzada con dichos pólenes. -Se puede asociar a SAO Omega 5 gliadina Asociada a anafilaxia inducida por ejercicio 31

ISAC CRD 103 Alérgenos de origen vegetal LTP • Proteínas termoestables a proteasas digestivas, causantes de reacciones en alimentos cocinados asociadas a reacciones sistémicas graves 32

Alérgenos de origen vegetal -Marcadores de reactividad cruzada Panalérgeno que muestra una gran homología y reactividad cruzada entre profilinas de diversas especies vegetales, incluso entre aquellas alejadas filogenéticamente. En algunos casos asociados a SAO en síndromes a polen-frutas. 33

Alérgenos de origen vegetal -Marcadores de reactividad cruzada Marcador de sensibilización de reactividad cruzada por determinantes carbohidratos. Raramente asociado con síntomas clínicos pero posible causa de reacciones en algunos pacientes 34

Alérgenos no vegetales -Marcadores especie específicos Anisakis Ani s 1 35

Marcadores de reactividad cruzada Ag mayoritario del pescado y panalérgeno de este grupo. Marcador de reactividad cruzada entre especies de pescados y anfibios. Proteína estable al calor y a la digestión, causando reacciones con alimentos cocinados Proteína fijadora de actina localizada en las fibras musculares. Marcador de reactividad cruzada entre artrópodos (crustáceos, arácnidos e insectos) 36

Estudios de validación de la técnica de microarrays en alergia alimentaria 37

Allergy 2008 N=130 niños con sospecha de alergia alimentaria mediada por IgE En todos ellos Prueba de Provocación con leche de vaca y/o huevo 38

Microarrays (ISAC CRD 51, VBC Genomics) Prueba cutánea IgE esp (CAP) Microarrays (ISAC CRD 51, VBC Genomics) Ovomucoide (Gal d 1) Ovoalbúmina (Gal d 2) Lysozyma (Gal d 4) Alfa lactoalbumina (Bos d 4) Beta lactoglobulina (Bos d 5) Caseína (Alfa, beta, kappa) 39

PP realizadas PP positivas Leche 85 42 (49%) Huevo 60 45 (75%) n=130 145 provocaciones DBPCFC PP abierta PP realizadas PP positivas Leche 85 42 (49%) Huevo 60 45 (75%) 40

Asociación entre el nº de componentes reconocidos en el microarray y CAP frente al extracto 41

PP como parámetro de referencia para análisis de curvas ROC para PC , CAP y Microarray LECHE 42

HUEVO 43

LECHE No encuentran dif significativas entre los valores de área bajo la curva (AUC) entre PC, CAP y Microarray 44

El resto de componentes, respuesta similar HUEVO Solo el Gal d 4 (lisozima) arroja valores inferiores de AUC, respecto al extracto completo El resto de componentes, respuesta similar La combinacion de todos en Microarray similar a CAP y PC 45

Puntos de decisión clínica LECHE n=85 HUEVO n=60 46

Ninguna prueba in vivo o in vitro permite el diagnostico definitivo en el 100% de los casos de Alergia alimentaria Los microarrays frente a componentes de leche y huevo nos dan resultados equivalentes a los encontrados con PC y/o IgE esp Ningún componente exclusivo discrimina entre una sensibilización irrelevante y una sensibilización genuina 47

Leche Lactoferrina bovina es un Ag mayoritario en alergia a leche. Frecuencia de reconocimiento de alérgenos en alérgicos y no alérgicos Perfiles de reconocimiento de Ag leche en alérgicos y no alérgicos 40 sueros con IgE total entre 72 y 18591 kIU/L e IgE específica a proteínas de leche entre 3 y 190 kIU/L. 6 sueros con IgE total entre 66 y 13242 kIU/L y sin alergia a leche, como controles negativos. Tecnica uarray propia Lactoferrina bovina es un Ag mayoritario en alergia a leche. Caseinas: alfa s1 es mas alergénica 48

Pediatric allergy Immunol 2007 sIgE trigo sIgG4 trigo La media de los valores IgE/IgG4 es mayor en el grupo PP + El valor IgE/IgG4 podría indicarnos la gravedad y el progreso de la dermatitis atópica de un paciente y ser mejor indicador que la IgG absoluta. Dermatitis atópica por alimentos con PP positiva o negativa IgE, IgG4 Ag-específica mediante microarrays (tecnica propia) para leche, clara de huevo, soja y trigo. 49

Mapeo de Epitopos. Microarray Peptidos LECHE CACAHUETE Flinterman AE, Knol EF, Lencer DA, Bardina L, den Hartog Jager CF, Lin J et al. Peanut epitopes for IgE and IgG4 in peanut-sensitized children in relation to severity of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol 2008; 121(3):737-43. Shreffler WG, Beyer K, Chu TH, Burks AW, Sampson HA. Microarray immunoassay: association of clinical history, in vitro IgE function, and heterogeneity of allergenic peanut epitopes. J Allergy Clin Immunol 2004; 113(4):776-82. Shreffler WG, Lencer DA, Bardina L, Sampson HA. IgE and IgG4 epitope mapping by microarray immunoassay reveals the diversity of immune response to the peanut allergen, Ara h 2. J Allergy Clin Immunol 2005; 116(4):893-9. Cerecedo I., Zamora J., Shreffler G.W., Lin J, Bardina L, Dieguez M.C. et al. Mapping of the IgE and IgG4 sequential epitopes of milk allergens using a peptide microarray-based immunoassay. J Allergy Clin Immunol 2008.122:589-594 Estudios de perfiles de sensibilización frente a epítopos diversos o fracciones de proteínas útiles en predecir la historia natural de la alergia alimentaria Jarvinen et al JACI 2002 Jarvinen et al JACI 2007 Vila et al CEA 2001 50

Reconocimiento Epitopos Lineales Aplicación clínica ¿Biomarcadores de distintos fenotipos clínicos? Gravedad clínica Pronóstico (persistencia de alergia) Diseño de dianas terapéuticas futuras Elección de pacientes para tratamiento IT ( inmunoterapia) ITO (inducción tolerancia oral) 51

Reconocimiento Epitopos Lineales LECHE JACI 2001 Persistencia de alergia leche 96 decapéptidos con aa de αs1-caseina. SPOT 24 niños (persistente >9años, posible no-persistente <3años) 52

Reconocimiento Epítopos Lineales LECHE 53

Reconocimiento Epitopos Lineales LECHE JACI 2002 Reconocimiento diferencial de epítopes frente a proteínas de leche de vaca entre pacientes -alergia a leche persistente (n=10) -alergia transitoria (n=10) 5 epitopes: 2 en alfa s1 caseína 1 en alfa s2 caseína 2 en kappa caseína no fueron reconocidos por los alérgicos transitorios y sí por los persistentes Peptido AA 123-132 de la alfa s1 caseína: Marcador de persistencia 54

Epitopos Lineales LECHE Reconocimiento Epitopos Lineales LECHE Beyer K, Jarvinen KM, Bardina L, Mishoe M, Turjanmaa K, Niggemann B, Ahlstedt S, Venemalm L, Sampson HA J Allergy Clin Immunol. 2005,116:704-5. Peptide-specific IgE for individual peptides at time of clinically relevant allergy in 3 groups of patients: (A) with persistent CMA, and (B) with late and (C) with regular tolerance development. Letters highlight the patients with the highest levels for the individual peptides. Epitopos informativos de persistencia de alergia a leche 55

Mapeo de Epitopos. Microarray Peptidos LECHE -Desarrollan un microarray de proteínas alergénicas de leche para mapear sus epítopos a gran escala, mediante péptidos de 20 amino ácidos incluyendo las secuencias primarias de αs1-caseina, αs2-caseina, β-caseina, κ-caseina y β-lactoglobulina. -Comprueban su reproducibilidad, especificidad y sensibilidad. -En base al solapamiento de amino ácidos, son identificados nuevos epítopos: αs1-caseina, Aas 49-62; αs2-caseina, Aas 69-77; β-caseina, Aas 16-39; β-lactoglobulina, Aas 106-119. El inmunoensayo basado en microarrays de péptidos puede proporcionar un método para el diagnóstico de alergia a leche 56

LECHE J Allergy Clin Immunol 2010;125:695-702 Sujetos con alergia a leche reconocen una mayor diversidad de epítopos unidos a IgE comparado con los que han superado su alergia, y éstos, similar a los sujetos tolerantes. 57

LECHE J Allergy Clin Immunol 2010;125:695-702 La unión de mayor número de péptidos a IgE está asociada a reacciones más graves durante las pruebas de provocación. 58

Reconocimiento Epitopos Lineales Huevo Pacientes con alergia persistente a huevo producen IgEesp frente a mayor número de epítopes lineales y conformacionales de ovomucoide y albúmina Metodo screening para alergia persistente a huevo 59

Reconocimiento Epitopos Lineales Cacahuete J Allergy Clin Immunol 2004;113:776-82 Desarrollan un microarray basado en péptidos de cacahuete para mapear epítopos. 213 péptidos de 20 aminoácidos solapados de las secuencias primarias de Ara h 1 Ara h 2 y Arah 3. 77 pacientes alérgicos a cacahuete 15 controles. 60

Reconocimiento Epitopos Lineales Cacahuete B. Distintos perfiles de reconocimiento de la IgE de 8 pacientes. A. Frecuencia de reconocimiento de cada péptido en el microarray: 87% de los sueros de pacientes fueron positivos al menos a un péptido. Gran variabilidad entre los pacientes respecto al número de epítopos y el patrón de péptidos reconocidos. J Allergy Clin Immunol 2004;113:776-82 61

marray CAP Reconocimiento Epitopos Lineales Cacahuete 38 Pacientes con clínica 14 sólo cutánea 24 sistémica marray CAP Los pacientes con historia de reacciones multisistémicas más graves reconocen un mayor número de epítopos. A Determinando los niveles de IgE específica a alérgenos recombinantes mediante CAP-FEIA, no hay diferencia entre pacientes con reacciones más o menos graves. B LA DIVERSIDAD DE IgE CORRESPONDE A LA GRAVEDAD DE LA HISTORIA CLÍNICA J Allergy Clin Immunol 2004;113:776-82 62

Estudio prospectivo. 24 Niños. PO. Reconocimiento Epitopos Lineales. CACAHUETE Estudio prospectivo. 24 Niños. PO. -IgE e IgG4 epitopos peptidos (15 aa) Arah1, Ara h2, Ara h3. -Correlacion positiva entre diversidad de epítopos reconocidos por la IgE de un paciente y la gravedad -Tras 20 meses de seguimiento el patrón se mantiene estable. -No encuentran un grupo de péptidos que se asocie a gravedad 63

Graves PP. Negativa Ara h 1aa Ara h2 aa Ara h3 aa Tolerantes Controles Reconocimiento Epitopos Lineales. CACAHUETE Graves PP. Negativa Ara h 1aa Ara h2 aa Ara h3 aa Tolerantes Controles 64

Cacahuete J Allergy Clin Immunol 2010;125:191-7 OBJETIVO: diferenciar entre alergia a cacahuete y tolerancia mediante el diagnóstico basado en componentes (CRD) usando microarrays. METODOS: Comparar el perfil de sensibilización entre niños sensibilizados a cacahuete (IgE > 0,2 kUa/L), alérgicos (n=29) o tolerantes (n=52), usando microarrays con 12 componentes (alérgenos mayores y alérgenos con potencial reacción cruzada). 65

ALERGIA A CACAHUETE Y GRAMINEAS PANEL DE COMPONENTES Y CARACTERISTICAS DE LOS DIFERENTES PERFILES DE RECONOCIMIENTO DE COMPONENTES CONTROL NEGATIVO ALERGIA A CACAHUETE Y GRAMINEAS ALERGIA A CACAHUETE ALERGIA A GRAMINEAS Y SENSIBILIZACION ASINTOMATICA A CACAHUETE 66

ALERGIA A CACAHUETE Y GRAMINEAS CONCLUSIONES: PANEL DE COMPONENTES Y CARACTERISTICAS DE LOS DIFERENTES PERFILES DE RECONOCIMIENTO DE COMPONENTES CONTROL NEGATIVO ALERGIA A CACAHUETE Y GRAMINEAS CONCLUSIONES: Hay diferencias notables entre el patrón de sensibilización de niños alérgicos y tolerantes a cacahuete. El componente Ara h 2 es el más importante para predecir alergia clínica a cacahuete. El CRD usando microarray puede facilitar el diagnóstico de alergia a cacahuete. ALERGIA A CACAHUETE ALERGIA A GRAMINEAS Y SENSIBILIZACION ASINTOMATICA A CACAHUETE 67

Cacahuete Verde - Toleran cacahuete Rojo- Alérgicos a cacahuete 68

Trigo Desarrollan un microarray de moléculas alergénicas purificadas y recombinantes para diferenciar el diagnóstico entre alergia alimentaria inducida por trigo, alergia a polen y el “asma de panadero”. Alérgenos de semillas de trigo recombinantes (10, 37, 38, 112, 123, 126). Extracto de polen de trigo (WP). Alérgenos de polen recombinantes (Phl p ). Marcadores de IgE (1 -13). 69

n = 22 Trigo n = 32 n = 17 70

2. Alergia alimentaria al trigo. 3. Alergia al polen de gramíneas. Usando 4 de los alérgenos recombinantes de semillas de trigo se puede diferenciar entre alergia al trigo respiratoria y alimentaria, ya que los pacientes con asma del panadero están sensibilizados a éstos alérgenos, mientras que los de alergia alimentaria no están sensibilizados. Es posible desarrollar un microarray basado en alérgenos recombinantes de trigo y alérgenos de polen útil para la discriminación de las 3 condiciones clínicas de alergia trigo. 1. Asma del panadero. 2. Alergia alimentaria al trigo. 3. Alergia al polen de gramíneas. 71

Nuestra experiencia 72

DIAGNOSTICO por Componentes perfiles de sensibilización en alergia a melocotón 73

TAB IgE esp 74

DIAGNOSTICO POR MICROARRAYS 75

11 Pacientes con Anafilaxia postprandial Cabrera et al Allergy 2008 11 Pacientes con Anafilaxia postprandial 8 adultos (4 mujeres y 4 varones) y 3 niños varones. 4 de estos pacientes presentaron anafilaxia por ejercicio postpandrial. -Sensitisation to LTPs , detected by Microarray ISAC CRD, was found in 63% of our patients with anaphylaxis, so it should be studied in patients with this pathology, given its ubiquity in different vegetables. -The microarray technique allows a more accurate diagnosis of sensitisation in some pathologies, such as anaphylaxis. 11 10 Number of cases 9 8 N = 7 7 6 5 63% 4 3 2 N = 1 N = 1 1 9% 9% LTP TPM PROFILIN 76

Tropomiosinas Acaros-gamba gamba cucaracha Anisakis CAP caracol Der f 1 Der f2 Der p1 Der p2 Der p 10 D1 Pen i 1 Pen m1 Per a 7 Hel as 1 Ani s 3 NAS 37,71 68,86 41,36 70,78 3,83 7,79 6,3 2,92 3,34 3,31 AAL 114,68 26,92 68,65 26,9 38 11,57 9,55 3,32 2,96 10,46 IGR 21,68 25,32 26,98 17,5 19,46 12,89 7,28 9,57 10,27 DRT 9,15 5,04 11 6,93 9,34 >100 10,63 8,02 3,37 5,15 6,17 JFD 125,25 51,78 57.57 142,13 135,16 78,57 GCR** 27,5 5,6 12,87 15,27 27,18 28,94 21,97 * tropomiosina recombinante de gamba ** Detector de marisco. IT sl ácaros CAP gamba caracol cucaracha Anisakis p4 f351* 2,79 3,51 2,28 23,2 77

Tropomiosinas testadas en el microarray. Der p 10 Per a 7 Ani s 3 Pen i 1 Pen m 1 -mismo patrón de reactividad -alta homología entre todas ellas 78

CASOS CLÍNICOS 79

Paciente polínico con alergia alimentaria Paciente varón 12 años Clínica de asma bronquial y rinoconjuntivitis de abril a junio, que precisa de tratamiento diario Con la ingesta de cacahuetes, cuadro de edema y urticaria generalizada IgE total: 907 kUA/l IgE esp Alternaria:13,9 KUA/l Phleum G5: 7,09 kUA/l Olivo t9: 8,02 KUA/l Plantago: 7,41 KUA/l Cacahuete:>100 kUA/l Melocotón:4,72 kUA/l Varón de 12 años que por la historia clínica parece claramente un paciente polínico con probable sensibilización a pólenes de gramíneas, y urticaria aguda por frutos secos. Al realizarle las pruebas cutáneas nos encontramos sensibilización a múltiples pólenes, alimentos, alternaria. In vitro por las técnicas convencionales, podríamos decir que tiene sensibilización clínica a gramíneas, y olivo y cacahuete, subclínica a alternaria y melocotón 80

LTP Profilinas Al realizarle la determinación de componentes por microarrays, nos encontramos que el perfil de sensibilización de este enfermo es el siguiente: Sensibilización a profilinas, lo que justifica la positividad a múltiples polenes en pruebas cutáneas y a los alimentos vegetales. Sensibilización a LTP justifica la clínica sistémica con cachuete y la positividad del melocotón en prueba cutanea. Sensibilización subclínica al cipres. Este paciente hubiera recibido inmunoterapia con gramíneas, siendo negativa la sensibilización a alérgenos mayores por la técnica de microarrays 81

Sensibilización subclínica al ciprés. Sensibilización a profilinas, lo que justifica la positividad a múltiples pólenes en pruebas cutáneas y a los alimentos vegetales. Sensibilización a LTP justifica la clínica sistémica con cachuete y la positividad del melocotón en prueba cutanea. Sensibilización subclínica al ciprés. Profilinas Enesta diapositiva vemos el resto de alergenos del microarrays. 82

Paciente anafilaxia por ejercicio Paciente varón de 22 años con episodios repetidos (3) compatibles con anafilaxia realizando ejercicio físico al aire libre. Desde la infancia rinoconjuntivitis estacional que ocasionalmente precisa de antihistamínicos Triptasa urg: 10,90 bas: 4,70 IgE total 670 kU/L IgE esp: gram1: 1,88 kU/L rgram1: 6,27 kU/L trigo:0,32 kU/L omega5-gliadina: 5,72 kU/L Este caso de sensibilización a la omega5 gliadina es el alergeno mayor de la anafilaxia inducida por ejercicio y dependiendiente del trigo (WDEIA). Es una proteina de almacenamiento de semillas. Hay trabajos que demuestran como las tranglutaminas intestinales unidas a la omega5 gliadna forman un complejo que es el reponsable de la anafilaxia 83

Rinoconjuntivitis. Sensibilización a gramíneas Paciente varón de 22 años con episodios repetidos (3) compatibles con anafilaxia realizando ejercicio físico al aire libre. Desde la infancia rinoconjuntivitis estacional que ocasionalmente precisa de antihistamínicos Exploraciones Triptasa urg: 10,90 bas: 4,70 IgE 670 IgEAg: gram1: 1,88 rgram1: 6,27 trigo:0,32 omega5-gliadina: 5,72 kU/L Rinoconjuntivitis. Sensibilización a gramíneas Anafilaxia inducida por ejercicio. Sensibilización al trigo (omega5-gliadina) Este caso de sensibilización a la omega5 gliadina es el alergeno mayor de la anafilaxia inducida por ejercicio y dependiendiente del trigo (WDEIA). Es una proteina de almacenamiento de semillas. Hay trabajos que demuestran como las tranglutaminas intestinales unidas a la omega5 gliadna forman un complejo que es el reponsable de la anafilaxia 84

Paciente alergia ácaros y alimentos Varón de 5 años, diagnosticado de asma bronquial mal controlado, rinitis persistente y anafilaxia con marisco. Primera consulta IgE total 1483 KU/L IgE Ag (CAP) D.pteronyssinus 7KU/L, gamba 13 KU/L Segunda consulta: Asma bronquial controlado con corticoides inhalados y antileucotrienos. Medidas de desalergenización ambiental. IT?? 85

Asma bronquial controlado Alergosis alimentaria crustáceos Sensibilización tropomiosina No inmunoterapia. 86

Paciente Síndrome ave-huevo Mujer, 43 años. Trabaja en hostelería sin contactar con alimentos. Desde los 18 años con la ingesta de huevo no cocinado: - prurito faríngeo, - dificultad respiratoria y para la deglución - edema labial. Al contacto con huevo (no con la cáscara) y con pollo: - prurito palmar - lesiones “maculares” blanquecinas en palmas de las manos Años más tarde con huevo cocinado y productos que contienen huevo dificultad respiratoria y para la deglución En ambientes donde hay periquitos o cuando se cocina huevo o pollo: malestar general Anteriormente toleraba huevo en todas sus presentaciones. Evita la ingesta de huevo y de aves (codorniz, pollo...) de forma absoluta desde hace 4 años, permaneciendo asintomática durante este tiempo. Durante su infancia convivió con gallinas !!! 87

Diagnóstico molecular Microarray: Pruebas cutáneas (prick): Histamina 4x4 mm Clara de huevo: 5x5 mm Yema de huevo: 6x7 mm Mezclas plumas pato-pollo: 4x3 mm Canario plumas:4x4mm IgE específica: - ovomucoide < 0,35 kUA/l - ovoalbúmina 0,52 kUA/l - Plumas de canario: 1,67 kUA/l Diagnóstico molecular Microarray: Unica positividad a Gal d 5 Alfalivetina o seroalbúmina del huevo DIAGNÓSTICO Síndrome de ave-Huevo 88

PARVÁLBUMINA Proteína muscular controla flujo de Ca++. Termoestable. Alérgeno mayoritario del pescado (b-parvalbúmina). Similitud entre diferentes especies. Menor en el músculo rojo ( atún, emperador tienen menor cantidad de parvalbúmina) En microarray: parvalbúmina de carpa y bacalao Ejemplo de cuatro casos en los que hay una relación directa entre el valor de IgE específica de merluza y parvalbúmina. 89

-Biomarcadores de fenotipos clínicos -Predicción de gravedad Conclusiones El diagnóstico por componentes mediante tecnología de microarrays de IgE específica -Perfiles de sensibilización -Confirma reactividades cruzadas -Precisión en las indicaciones del tratamiento mediante IT Ag-específica -Monitorización de la respuesta inmunológica tras IT Diagnóstico refinado -Biomarcadores de fenotipos clínicos -Predicción de gravedad 90

-El análisis de microarrays abre nuevas opciones en el diagnóstico de alergia a alimentos. -Permite medir un numero de proteínas mucho mayor para un mismo paciente. -Sin embargo también es el mayor inconveniente de la técnica. Nuestro actual conocimiento del significado de resultados positivos a muchas proteínas es limitado. -Para el buen uso de esta técnica en el diagnóstico de alergia alimentaria habrá que establecer los perfiles de los resultados en relación con el perfil clínico especifico para cada paciente. -Hace falta un buen análisis. Valoraciones clínicas con un alto poder estadístico 91

Demasiada información no siempre es una buena información!!! 92

Pamplona 7-8 Mayo 2010 GRACIAS!! 93

Nuevo ISAC CRD 130 Nuevas proteínas de alimentos Melocotón: Pru p 4 (profilina) Nuez: Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3 y Jug r 4 Anacardo : Ana o 2 Cacahuete: Ara h 9 Soja: Gly m 2s Trigo: Tri a 114 (LTP) Alforjón: Fag e 16 KD Leche: Lactoferrina Clara de Huevo: Gal d 4 (lisozima) Gamba: Pen m2 y Pen M 4 94