Aplicación de la biotecnología en la mejora y conservación de especies forestales Chávez Ornela Colunga, Raúl Domínguez, Fernando Fedrigo, María E. Gaona, Romina Marassi, M. Lorena

Investigación en biotecn0logía forestal 1) Avances en estrategias y herramientas genómicas Principales estrategias en genómica Situación en Argentina 2) Organismos genéticamente modificados Objetivos Ejemplos en América Latina

1) Avances en estrategias y herramientas genómicas (Principales estrategias) Las técnicas de marcadores moleculares para la localización de genes simples y loci involucrados en características cuantitativas (QTLs) han permitido identificar intervalos genómicos “relativamente amplios”, y por lo tanto decenas o centenas de genes, y no los genes efectivamente involucrados en el control de la característica.

Sólo una estrategia de mapeo de polimorfismos de secuencia que estén suficientemente próximos a una mutación funcional revelará asociaciones entre marcadores moleculares y caracteres de interés, mas precisas. Información de estos mapas, conjuntamente con la generada por diversos proyectos genómicos de Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa y Eucalyptus grandis , permitieron el desarrollo de nuevas estrategias para la identificación de genes involucrados en características de interés

Con la info. Genómica disponible, se ha utilizado la estrategia del “análisis del gen candidato” para la identificación de genes subyacentes en QTLs, por ej. En el pino, genes involucrados en la sintesis de lignina. En Eucalipto, mediante la estrategia de “genética genómica” se vio que QTLs para crecimiento colocalizaron con eQTLs (expressed QTLs) para genes relacionados a contenido de lignina, sugiriendo que crecimiento y lignina estarían controlados por los mismos loci. En álamo, se estudiaron combinadamente QTLs, microarreglos y genes candidatos para identificar genes involucrados en tolerancia a sequía

Para determinar loci y alelos responsables de las diferencias fenotípicas, se emplea el “mapeo de asociación” a partir de la busqueda de variantes de genes candidatos. En contraste con el mapeo de QTLs, los marcadores que muestran asociación con un carácter fenotípico, están muy cerca o directamente en el gen que influye en el carácter

Estas estrategias se refieren al estudio de la variabilidad de los fenotípos naturales para la búsqueda de las variantes genéticas que los causan. Pero no son las unicas, existen otras alternativas que consisten en la modificación de un fenotipo, a través de los análisis de anulación (knock out) o sobreexpresión de un gen mediante plantas transgénicas

Independientemente de las estrategias utilizadas, una vez identificados los fenotipos beneficiosos, pueden seguirse dos caminos: 1) identificar genotipos que contengan estos alelos de interés e introducirlos en los programas de mejoramiento/conservación 2) modificar genéticamente clones elite con estas variantes

SITUACIÓN EN ARGENTINA: Estudios de Genética Ecológica Forestal La desforestación a nivel mundial y en Argentina avanza constantemente, por lo cual urge actuar rápidamente en la conservación del bien común forestal, ya que de el depende la conservación de la diversidad genética y el uso adecuado de la misma en procesos productivos.

A) Procesos evolutivos a grandes escalas espaciotemporales Los diferentes marcadores moleculares en función de su utilidad para reflejar el verdadero nivel de variación genética a diferentes escalas espacio temporales son: Marcadores A) Procesos evolutivos a grandes escalas espaciotemporales B) Procesos evolutivos recientes C) Impacto actual de disturbios de diversidad genética en escala local

A) Se destaca el uso de marcadores geneticos de ADNm o ADNcp La organización molecular del genoma de cloroplasto es extremadamente conservada por lo que diferentes taxones mantienen un mismo arreglo lineal de sus genes Esto permite el monitoreo de la distribución espacial de su variación y en grandes escalas y la reconstrucción de su historia evolutiva y rutas migratorias.

B) Para los objetivos del segundo grupo de marcadores, se utiliza principalmente la información del ADN nuclear, sujeta a una mayor tasa de mutación, herencia biparental y recombinación de la info. Genética Ejemplo: Estudios realizados en Austrocedrus chilensis permitieron encontrar que las poblaciones de esta especie, fuera de los parques nacionales, son las que contienen la mayor diversidad genética

C) El tercer grupo de marcadores es utilizado en estudios de procesos de importancia evolutiva y de genética espacial a escala local, los cuales requieren marcadores hipervariables, codominantes o dominantes. Entre estos procesos figuran estimaciones de flujo polínico actual, estructuración genética en diferentes estratos generacionales, impacto del uso silvícola en la diversidad genética, etc.

Marcadores de utilidad en la producción y mejora, en huertos semilleros de especies forestales de rápido crecimiento Un huerto semillero constituye una plantación de clones o progenies seleccionados intensivamente sobre la base de características de importancia económica

Correcta identificación de clones elite Para la PRODUCCION, los marcadores mas utilizados son los microsatelites, también llamados SSRs, con el objeto de: Correcta identificación de clones elite Identificación de los progenitores Estimar el nivel de contaminación de polen de fuentes externas en huertos semilleros. Conservar únicamente aquellos clones o individuos que han sido de importancia económica Los cuales constituyen factores críticos en la producción de especies comerciales.

Otra importancia de los marcadores en huertas como por ejemplo de Eucalyptus, es evitar la endogamia, suceso que conlleva a consecuencias desfavorables en la producción como son: Reducción de los niveles de producción de semillas Reducción de la altura y volumen de la planta Deformación de las hojas y de tallos. Para lo cual el uso de los marcadores es imprescindible, permitiendo evitar la implantación de clones genéticamente relacionados en bloques continuos..

En cuanto a la MEJORA de población se utilizan junto a los SSR, los AFLP con la finalidad de diseñar clones a partir de la selección de un organismo con caracteres morfometricos de interés que maximicen el progreso en la mejora genética, optimizar la estructura de las poblaciones de MEJORA y PRODUCCION y desarrollar nuevas estrategias de selección.

EVALUACION DE VARIABILIDAD FUNCIONAL EN PROGRAMA DE MEJORAMIENTO Y DOMESTICACION En los programas de mejoramiento y domesticación de Argentina, se incorporaron y desarrollaron nuevas estrategias dirigidas a optimizar la calidad de la madera en especies del género Eucalyptus, como así también analizar características adaptativas en especies nativas. FINALIDAD: Detectar variantes alélicas responsables de la expresión del carácter.

2 ejemplos: 1) El contenido y composición de lignina es importante en la producción de pulpa para la industria del papel, pero por otro lado, el bajo contenido de este polímero también es importante para la utilización de los residuos forestales en la generación de biocombustible (bioetanol).

En una primera etapa se caracterizo un huerto semillero clonal (27 arboles) de E. grandis. Tanto la variabilidad de los genes candidatos involucrados en la vía metabólica como en el contenido y composición de lignina, se encontraron escasas diferencias fenotípicas entre individuos y algunas variantes alélicas diferentes. En cuanto a la búsqueda de QTLs asociados a densidad de madera se trabajó en poblaciones segregantes locales de E. grandis y en el desarrollo de marcadores funcionales de tipo EST-SSR a partir de secuencias publicadas de E. globulus.

2) Segunda aplicación del programa: estudio de la variabilidad a nivel de nucleótidos de genes involucrados en tolerancia a estrés tales como sequia y salinidad. Los genes seleccionados se estudiaron en las poblaciones de Austrocedrus chilensis y Prosopis spp. (siendo éstas especies forestales nativas de importancia económica, de rápido crecimiento y con un alto potencial adaptativo)

A partir de ESTs de Pinus pinaster, P A partir de ESTs de Pinus pinaster, P. taeda, Prosopis juliflora y genes de Arabidopsis y Criptomeria japonica, se diseño de cebadores, amplificación y análisis de fragmentos con alto porcentaje de similitud a los depositados en la base de datos. En Austrocedrus chilensis se analizaron porciones de los genes Pal 3, LP3-1 y Aquaporinas en genotipos contrastantes sin detectar aun asociación. En Prosopis se evaluaron 5 genes en genotipos de las especies Prosopis flexuosa, P. chilensis Y P.alba con comportamientos contrastantes frente al estrés hídrico.En los genes HAK3P, ERD 15, PHD finger y Rab7 se detectaron SNPs diferenciales entre especies que habitan las distintas regiones.

Conclusiones y perspectivas Marcadores moleculares para manejo asistido de poblaciones de mejora y en genética ecológica, han sido aplicados en Arg. Avances logrados mundialmente a nivel genómico en especies modelo podrán ser utilizados en otras especies con el fin de explotar la variación genética de poblaciones de mejora o nativas. Para el descubrimiento de nuevos genes, será también necesario generar e incorporar en bases de datos publicas, secuencias de ESTs, logradas a través de experimentos en géneros y especies en las que las disponibilidad actual de proyectos de secuenciación no este prevista o sea difícil por la complejidad del genoma (coníferas). A partir de estas bases de datos y de las metodologías de alto desempeño se podrán detectar gran cantidad de SNPs en forma paralela, a un costo razonable y finalmente podrán utilizarse en estudios de asociación genética.

Por lo tanto, la genética de asociación promete ser la estrategia elegida en todos los géneros y en donde el objetivo es correlacionar la distribución de los genotipos de los genes candidatos como secuencias de ADN, y los fenotipos relevantes. Por esta razón, seguirán siendo clave la selección de los genes candidatos, la capacidad de caracterizar apropiadamente los fenotipos y la habilidad de utilizarlos para manipular vía mejoramiento molecular o transgénesis. Todas estas metodologías, además de mejorar el conocimiento del control genético de características de interés(alelos de importancia económica y ecológica), reducirían los costos y tiempos de mejoramiento y ayudaran en la conservación.

2-Modificación Genética de Especies Forestales Sistemas de transformación: Agrobacterium tumefaciens en Angiospermas y bombardeo de partículas en Gimnospermas Problemas: regeneración de plantas Una de las aplicaciones mas importantes es: investigación biológica de los árboles. Utilización comercial: es esencial disponer de marcos reglamentarios para el ensayo, seguimiento y gestión de OGM, utilizando reproducción controlada.

Objetivos estudio de la funcionalidad de los genes Aumento en la producción de biomasa Cambios en la estructura de la madera Aumento de la tasa de crecimiento Incremento del volumen del tronco Periodo de reposo Introducir resistencia a insectos y hongos tolerancia a herbicidas tolerancia a estrés biótico y abiótico

Para ello: -Se han modificado la expresión de genes que participan en la síntesis de hormonas vegetales por ejemplo: gen ipt de Agrobacterium tumefaciens, que codifica una enzima para la producción de citocininas. -se han sobreexpresado o inhibido genes involucrados en la síntesis de lignina. Por ejemplo en álamo, pino y eucaliptus, reduciendo la expresión del gen 4cl y aumentando la del gen f5h se redujo un 45% el contenido de lignina y se aumento de 15% de celulosa -se ha logrado árboles tolerantes a suelos ácidos y sequia, con el gen DREB1A de Arabidopsis thaliana en híbridos de Eucalyptus grandis x E. urophylla

Modificación de la floración: esterilidad reproductiva, utilizando gen PTD de Populus trichocarpa Utilización de plantaciones fitorremediar: híbridos de Populus usando gen de mamíferos del citocromo P450 para detoxificar tricloroetileno; se ha sobreexpresado un gen de fitoquelatinas para la eliminacion de cadmio

Árboles transgénicos en América Latina En algunos países de América Latina se están desarrollando proyectos de transformación genética de árboles para su comercialización: En chile se está tratando de obtener pinos resistentes a la mariposa del brote. investigadores brasileños, han participado en el desarrollo de álamos y eucaliptos transgénicos. Empresas brasileñas están desarrollando eucaliptos con la cantidad de lignina modificada, para la producción de papel. -En México se están ensayando nuevos genes para incrementar el crecimiento en Pawlonia sp. En Argentina, tanto el INTA como la UNLP han iniciado proyectos de modificación génica de clones de álamos para modificar la lignina, para tolerancia a herbicidas y resistencia a insectos.

Conclusiones La modificación genética en el sector forestal es mas que una cuestión técnica hay que tener en cuenta: -los valores socio culturales –los múltiples usos e los bosques – la aceptación de la opinión publica Se necesitan protocolos fiables, experimentados y convenidos para evaluar los riesgos de los arboles forestales genéticamente modificados. En consecuencia el desarrollo, ensayo y aprobación de los arboles forestales genéticamente modificados, para una utilización mas general puede sufrir costos elevados y tener plazos muy largos.

La manipulación genética a nivel forestal se realiza en al menos 25 países. En china se establecieron plantaciones de arboles genéticamente modificados, con genes de resistencia a insectos. Si se decide liberar comercialmente estos arboles es condición utilizar materiales con reproducción controlada. La madera es vital para la economía mundial, pero la presión del desarrollo humano y el crecimiento de la demanda están contribuyendo a la degradación de ecosistemas forestales naturales. La modificación genética y otras biotecnologías pueden tener una función importante en las plantas forestales.