Aislamiento del producto Luego de la formación del producto de interés procederemos a su aislamiento. En este caso particular consideramos como producto: Proteína CAROLINA VITA

Aislamiento de una proteína Se requiere conocimiento de la proteína De que tipo de célula proviene De que parte de la célula Qué hace esa proteína Particularmente útil si se conoce : Tamaño Composición

Aislamiento de una proteína Selección de la fuente proteica Ej: de tejidos de animalales como pollos, cerdos, vacas, ratas son los elegidos Distribución de la proteina (mayor concentración) Ej: microorganismos bacterias: E. coli Levaduras: Saccharomyces cerevisiae  Tecnicas de clonado molecular

Métodos de solubilización  Es el primer paso obligado de la purificación  la proteína debe estar en solución

Estabilizacón de la proteina Existencia de agentes que provocan un daño irreversible  pH T Proteasas Interfase agua–aire Adsorción a la pared de los recipientes Crecimiento de microorganismos  

En el caso de proteína intracelular  muy baja concentracion y acompanada de millares de proteinas y otras macromoleculas En el caso de proteínas extracelulares pueden estar en baja concentración y también acompañada o ser el principal producto extracelular

Estrategia Remover del organismo la proteína pura en la menor cantidad de pasos con la menor pérdida de actividad posible

Para ello se cuenta con métodos de purificación Objetivo Purificación de una proteína de interés Para ello se cuenta con métodos de purificación Los métodos se utilizan en etapas Serie de pasos independientes que utilizan las caracteristicas fisicoquimicas de las proteínas para separarlas de otras proteínas o de otras sustancias

Metodos de purificación Basado en las siguientes propiedades proteicas: Tamaño Solubilidad Carga Adsorción Afinidad

Procedimientos Tamaño Solubidad Polaridad Carga Característica   Procedimientos Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifufacion Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque Selectividad Cromatografia de afinidad

Tamaño Diálisis Utiliza membrana semipermeable donde moleculas de agua y las de solutos pequeños la atraviesen LAS PROTEÍNAS SON RETENIDAS

Diálisis

Tamaño Ultrafiltracion Se utiliza una membrana semipermeable que retiene las proteínas La presión o fuerza centrífuga se usa para separar por filtración el medio acuoso y las moléculas de tamaño pequeño Uso de celofán o membranas

Centrifugación Método separación y análisis Centrifugation en gradiente de densidad Gradientes continuos de sacarosa tubo de centrifuga Recuperación del materia: Se perfora el tubo o bien se congela y se corta en capas

Centrifugación Los componentes de la mezcla se separan por: Peso Tamaño Densidad Forma

Coeficiente de sedimentación S = M (1-V) N f M: peso molecular V: Volumen espécifico : densidad de la solución N : numero de avogadro F: coeficiente de fricción Las proteínas migran de forma proporcional a este coeficiente

Solubilidad Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación Mantiene nativa a la proteina Redisolucion sin perdida de actividad

Solubilidad Proteina composicion de aa  le otorga un comportamiento diferente La solubilidaad de la proteína depende: Interacción intraproteina Interaccíon proteína-proteína Interacción proteína- disolvente

Solubilidad Interacciones mencionadas dependen de: pH Fuerza iónica Disolvente Temperatura

Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5) Solubilidad-pH La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos El valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero  pI (punto isoelectrico) Solubilidad es mínina Ej: contenido de aa ácidos pI bajo (4-5)

Solubilidad-pH

Solubilidad-Fuera iónica Salting in Salting out

Salting in Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M) aumenta con la [ sales]  Salting in Las proteínas en H2O tienden a formar COMPLEJOS electrostáticos  precipitan Al aumentar la [sales] proteina se rodea de contraiones más soluble por > interacción proteína-solvente

La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteína Salting out La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales]  Salting out La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteína Sales capturan el H2O > interacción prot-prot

Solubilidad-Disolventes Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL) Se usan en distintas proporciones  Bajan el poder de solvatación de las soluciones acuosas

Solubilidad- Temperatura 0-40 oC >T > solubilidad. 40-50oC  inestabilidad DESNATURALIZAN ( solubilidad)