HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

HIBRIDACION: Es un proceso de técnicas por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas con secuencias de bases complementarias de ADN O ARN en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.

PRINCIPIOS BASICOS DE LA HIBRIDACION La presencia de la secuencia diana en uno de los fragmentos generalmente obtenidos con enzimas de restricción de la muestra de ácidos nucleicos. Un fragmento corto de acido nucleico denominado sonda de secuencias Para empezar, hay que contar con una secuencia diana (target) dentro de un fragmento de DNA y con una sonda (probe), que no es más que un fragmento pequeño de DNA de secuencia conocida y complementaria a la secuencia de diana. Cuando la sonda y la diana se encuentran, el dúplex se identifica con radiactividad, fluorescencia o colorante, según de la manera en que la sonda se haya marcado.

INFLUENCIA DE ALGUNOS FACTORES SOBRE LA HIBRIDACION la condensación de ADN o ARN diana . la concentración del tamaño de la sonda . la temperatura y el tiempo de hibridación . características del medio de reacción como ( la fuerza iónica , pH y concentración de agentes desnaturalizantes).

PROCESO QUE SE SOMETEN LOS ACIDOS NUCLEICOS DESNATURALIZACION: La doble hélice es muy estable en condiciones normales pero si se calienta o se le somete a cambios de pH o cambios de condiciones iónicas los puentes de hidrógenos se rompen y las cadenas se separan y la desnaturalización es reversible. RENATURALIZACION: Si se recupera las condiciones iniciales permite que se unan las dos hebras de distinta procedencia y forme una molécula hibrida de ADN. En el caso de ADN las dos hebras se separan y pasan a una conformación al azar sin que se altere la estructura primaria ya que no hay ruptura de los enlaces covalentes. En el caso de ARN por poseer una estructura tridimensional que a pesar de ser análoga con la estructura primaria .La desnaturalización afecta a los ARN ribosomal y ARN de transferencia ya que son las dos estructuras de doble hélice .

AGENTES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE HIBRIDACIÓN TEMPERATURA Temperatura Alta ADN se debilita el la doble hélice y las dos hebras se desenrollan asta separarse perdiendo la estructura secundaria y superior. Temperatura baja Tiene posibilidad que las secuencias complementarias se encuentren y se formen los fuentes de hidrogeno entre las hebras.

CONCENTRACIÓN: TAMAÑO DE LA SONDA (ADN): TIEMPO DE HIBRIDACIÓN:

RIGOR DE HIBRIDACION Rigor Alto: Rigor bajo: En el grado de especificidad en el apareamiento conseguimos en los híbridos la Capacidad de reconocimiento mutuo entre las dos cadenas con el fin de detectar que el ADN. El rigor depende de diversos factores experimentales. Rigor Alto: Aumento de la temperatura Aumenta la concentración formamida Disminución de la concentración salina Rigor bajo: Disminuye la temperatura Disminución de la concentración formamida Aumenta la

METODOS DE ENSAYO DE HIBRIDACION HIBRIDACIÓN EN FASE LIQUIDA: utiliza una muestra de ADN o ARN y se realiza su hibridación con la sonda al estar disueltas es mas rápida Se produce una hora o menos por lo que es un método practico y sencillo. Estudia a los ARN mensajeros empleando nucleasas 1 HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SOLIDO: Permite procesar muestras simultáneamente y nos facilita el control de hibridación Hibridación mas sencilla y mas versátil. Detección de las enfermedades moleculares en la base genética. HIBRIDACION “dot – blot” y “slot- blot” Es un método mas simple por su posibilidad de empleo con muestras de ácidos nucleicos sin purificar La muestra se aplica sobre gota a gota sobre un filtro de nitrogenasa cuya propiedad es absorción de las moléculas de ácidos nucleico y proteína.

METODOS O DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEOTIDOS Se basa en el estudio de las secuencias especificas del ADN o ARN tanto para su identificación como para su eventual identificación .y se parte de sondas que son secuencia s de ADN o ARN complementarias .

HIBRIDACION POR DISOCIACION Es utilizada para la evaluación de la asociación de una molécula de un acido nucleótido en la formación de doble cadena de ADN , DNA-RNA o doble RNA. Esta técnica es muy sensible pero solo sirve para cuantificar el contenido de un acido nucleico especifico

HIBRIDACION POR FIJACION Esta técnica consiste en la desnaturalización del DNA o RNA , inmovilizando en un soporte inerte como la nitrocelulosa , para hibridarlo posteriormente con una sonda marcada y así facilitar su detección .Esta técnica es conocida con los nombres de SOUTHERN BLOT NORTHERN BLOT

SOUTHERN BLOT Es la transferencia de un ADN denaturalizado desde un gel a un soporte de filtro donde puede ser hibridizado con una sonda de ADN complementaria. Combina la separación electroforética del ADN con sus transferencias a un soporte solido o filtro para su hibridación. Identificar el gen o fragmento genéticos de un tamaño anormal o ausentes Identificar mutaciones puntuales Consiste en 5 etapas Separación Desnaturalización Transferencia Hibridación detección

HIBRIDACION DE ADN Esta técnica se basa en tratar el ADN con enzimas de restricción y separa los fragmentos con electroforesis en un gel de agarosa . Se parte de ADN aislado del tejido tiene que estar en las mejores condiciones . El ADN tras cortarlo con enzimas de restricción se desnaturaliza para obtener fragmentos de cadenas sencillas que se transfieren del gel agarosa a un nitrocelulosa y es cuando se puede hibridar con sondas radioactivas o colometria la reacción se puede detectar por radioautografia ya que las sondas se pueden marcar radiactivamente.

SOUTHERN BLOT El proceso es igual al de southern pero difiere que este tipo de hibridación es realizada en ARN. Se utiliza para obtener información del tamaño de ARN y sobre el modelo de expresión de genes. Restricción para generar diferentes fragmentos Electroforesis en geles de agarosa Desnaturalización para permitir la unión a la membrana nitrocelulosa (UV NaOH). transferencia al papel de filtro por capilaridad Hibridación con sonda especifica Lavados Visualización de la sonda

HIBRIDACIÓN DE ARN Permite detectar la presencia de un transcripto (ARN).Es el primer nivel de expresión . Proporción información de su formación y procesamiento. la técnica se aplica para el arn para transferir ARN desde el gel de agarosa a un medio adecuado para la hibridación es necesario realizar algunas modificaciones pero el fundamento del método es el mismo. cuando el ARN se degrada fácilmente es una limitación que nos obliga a que todas las manipulaciones hayan que hacerlas en forma rápida y evitando el contacto de la muestra con ARNasas

HIBRIDACION POR IN SITU Es un método clásico y básico que combina las técnicas de biología molecular . Consiste en utilizar una sonda marcada de ADN o ARN y unirla al DNA o al RNA de una preparación citología o histológica . Recientemente se ha optimizado la técnica de hibridación in situ usando fluorescencia lo que permite detectar alteraciones puntuales y anormales cromosómicas tanto en interface como En metafase , tras hacer crece previamente las células in vitro. Con la caracterización del cariotipo y los ragos morfológicos de los cromosomas se pueden detectar anomalías en los mismos y numerosas translocaciones