UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Saccharomyces cerevisiae Microbiología de alimentos   Dr. Iván Salmerón I.Q. Edmundo Juárez Enríquez 213548 Q.B.P. Carolina Nájera Domínguez 207445 I.Q. Ana Herrera Ponce 207531 23/03/2011

INTRODUCCIÓN

Saccharomyces cerevisiae Clase: Hemiascomycetes Orden Saccharomycetales Familia: Sacchacromycetaceae Biomasa Tamaño: 5-10 micras Reproducción: gemación Etanol

En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento: Introducción En el transcurso de la fermentación hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de adaptación 2) exponencial o log 3) estacionaria 4) mortalidad

Introducción C6H1206 —» 2 CH3CH2OH + 2 CO2

OBJETIVO Monitorear el crecimiento de Saccharomyses cerevisiae, con el fin de medir el cambio de diferentes parámetros, como pH, consumo de azúcar, acidez y unidades formadoras de colonias, así como la duración de cada etapa del crecimiento

MATERIALES Y MÉTODOS

Microbiología III Alimentos I El monitoreo de la cinética de crecimiento de Saccharomyses cerevisiae, se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología III y Alimentos I, en la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua. La cepa empleada fue proporcionada por el Laboratorio de Microbiología III (Louis Pasteur) de dicha institución.

Preparación del Caldo de Crecimiento Glucosa 5 g/L Extracto de Malta 5% Solución M9 Inóculo 1% Preparación de la muestra Se preparó un medio de cultivo con glucosa 5 g/L , 5% de extracto de malta y 1% de solución M9, al cual se le inoculó Saccharomyses cerevisiae al 1% (v/v) a partir de una solución concentrada de la levadura, preparada con dos días de anticipación en un medio de cultivo igual al mencionado anteriormente. Inoculado el 15 de Marzo

Acidez y pH Acidez: valoración de la muestra con NaOH 0.1 N % de ácido acético Muestra directa en potenciómetro Hanna Instruments Hi225 Acidez y pH Se determinó la acidez mediante la valoración de la muestra con NaOH 0.1N y se expresó como porcentaje de ácido acético. El pH se determinó en un potenciómetro Hanna Instruments Hi225.

Cuantificación de consumo de sustrato Dubois y col. (1956) 1 mL muestra o estándar 0.6 mL Fenol 5% 3.6 mL H2S Cuantificación de consumo de sustrato Para realizar la cuantificación del consumo de sustrato se realizó la cuantificación de azúcares por el método propuesto por Dubois y col. (1956), el cual consiste en elaborar una curva de calibración preparada con estándares del carbohidrato de interés (glucosa) en el rango de 0 a 100 μg/mL, los cuales se miden a una λ=492 nm en un espectrofotómetro para posteriormente leer las muestras. Un mililitro de las muestras o estándares se vertió en un tubo de ensaye al cual se le agregaron 0.6 mL de fenol al 5%. Después se adicionaron lentamente 3.6 mL de ácido sulfúrico concentrado, se homogenizó y se dejó reposar por 30 minutos, la intensidad del color obtenido se midió en el espectrofotómetro PerkinElmer Lamda 25 a 492 nm y finalmente se relacionó la absorbancia leída y la concentración de glucosa (μg/mL), mediante la curva de calibración. ג 492 nm

Al momento de realizar la cinética de crecimiento, se separó 1 mL de la muestra Se centrifugó a 1500 rpm por 5 min El sobrenadante se guardó en refrigeración para su análisis al día siguiente

D.O. Determinar la D.O. a 600 nm (Durango, 2007) Espectrofotómetro PerkinElmer Lambda 25 Densidad óptica (D.O.) Se determinó mediante la lectura en un espectrofotómetro PerkinElmer Lamda 25 a 600nm de acuerdo a lo reportado por Durango (2007).

UFC Milles y Misra “ Método de la Gota” PDA X 2 37° C 12 horas 1 mL 10-1 10-2 10-3 10-4 PDA X 2 37° C 12 horas Conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) Para contar las unidades formadoras de colonias se utilizó el método de la gota (Miles y col., 1938), para lo cual se hicieron diluciones seriadas de 1 mL de muestra en 9 mL de buffer de fosfatos, hasta llegar a la dilución de 1: 100000. Por cada dilución se depositó una gota de 5µL en una placa de agar PDA, inoculando todas las diluciones en la misma caja. Este procedimiento se llevó a cabo por duplicado, en cada monitoreo (cada 2 h). Una vez absorbida la gota en el medio, las placas se invirtieron e incubaron a 37ºC hasta su conteo. (El método señala 12 horas de incubación, sin embargo, por cuestión del horario de monitoreo nos fue imposible contar al tiempo de incubación indicado, por lo cual contamos las colonias a las 29 horas de incubación).

Cinética de Crecimiento Microlector Blanco: caldo de crecimiento Cinética: caldo de crecimiento inoculado con Saccharomyces cerevisiae Monitoreo de la cinética de crecimiento en microlector de placas Se preparó un caldo de crecimiento y se inoculó la levadura, a continuación se depositaron 250µL de este caldo de crecimiento en dos hileras de una microplaca de 96 pocillos, adicionalmente se colocó una hilera con caldo sin inocular para utilizar como blanco. La microplaca se incubó a 25 ºC por 24 h, sin agitación y la D.O. se midió a 595 nm, en el microlector de placas Bio Tek, Modelo ELx 808. Los datos se recopilaron en el software Gen 5 para su posterior análisis con la ecuación de Baranyi y Mac Kella (software DMFit). Esto se realizó con el fin de tener un punto de comparación. 25 °C 24 horas D.O. 595 nm BioTek Gen 5

Monitoreo de la Cinética Manual Monitoreo de la cinética de crecimiento en el laboratorio Se tomaron muestras al inicio (t=0) y cada 2 h por 10 h, del caldo de crecimiento, a la cual se le determinó inmediatamente D.O., acidez y pH, además, se separó 1 mL de solución libre de células (por centrifugación a 1500 RPM por 5 min), para determinar posteriormente azucares. Además la misma muestra y 5 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000) se inocularon (por duplicado para cada monitoreo) en agar PDA con el fin de obtener las UFC.

RESULTADOS

Frotis

pH y Acidez

Densidad Óptica

Consumo de sustrato

UFC

Cuadro 1. Resultados del conteo de UFC por el “método de la gota”, agar PDA, incubación a 37ºC. El conteo se realizó a las 29 horas después de la toma de la primera muestra. Caja Monitoreo Directo 1:10 1:100 1.1000 1:10000 1.100000 Blanco - 1.1  X 1.2 2.1 1 2.2 3.1 2 3.2 4.1 3 4.2 5.1 4 5.2 6.1 5 6.2

GRACIAS!!