HISTOLOGÍA DRA. EDITH ACOSTA

Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas

 Del griego “Histos” = “Tejido”  Ciencia que estudia todo lo referente a los tejidos orgánicos: Estructura, desarrollo y funciones.  Rama de la anatomía que estudia los tejidos de animales y plantas. En su aspecto amplio, la palabra histología se emplea como sinónimo de anatomía microscópica ya que su materia incluye no sólo los tejidos si no la célula, órganos y sistemas. HISTOLOGIA CONCEPTO

 El objeto de la histología ya no aborda simplemente la estructura del cuerpo, si no también su funcionamiento. Esta ciencia guarda una estrecha relación con la biología celular, la bioquímica, fisiología y, según sea apropiado, la patología.  Las principales unidades de medidas utilizadas en histología son: UNIDADRepresentación y valor Micrómetro1 µm=0,001 mm Nanómetro1 nm= 0,001 µm

Métodos y técnicas  Métodos más comunes aplicados para estudiar la anatomía microscópica del cuerpo  Microscopía de Luz (Microscopio óptico)  Microscopía electrónica  El ME amplió considerablemente el campo de estudio de la histología por ser unas 1000 veces más potente que el MO.  Otros instrumentos y técnicas incluyen el cultivo de células, técnicas de autorradiografía y las de inmunohistoquímica que permiten localizar de forma exacta en los tejidos macromoléculas como proteínas, GAGs y lugares de actividad enzimática.

MICROSCOPÍA DE LUZ  Preparación de los tejidos con el fin de estudiarlos de manera que se asemejen más a su estado natural en vivo, se han creado diversas técnicas.  Permite obtener preparaciones histológicas permanentes (cortes) para su estudio al Microscopio Óptico (MO)  Con el MO se estudian los tejidos por transparencia por lo que se precisan cortes muy finos.

PREPARACIÓN DE CORTES HISTOLÓGICOS  Obtención  Fijación  Deshidratación o aclaramiento  Inclusión en un medio estable  Sección en cortes delgados  Montaje y tinción.

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA  Los tejidos se pueden obtener de diferentes formas:  Biopsia  Biopsia excisional  Biopsia incisional  Biopsia endoscópica  Biopsia colposcópica  Punción aspiración con aguja fina (PAAF)  Biopsia por punción con aguja gruesa (Tru-cut)  Necropsia/autopsia

BIOPSIA  La palabra biopsia está compuesta y procede del griego bio-, "vida", y -opsíā, "observar“  Una biopsia es un procedimiento diagnóstico que consiste en la extracción de una muestra total o parcial de tejido para ser examinada al microscopio por un médico anatomopatólogo.

BIOPSIA  Biopsia excisional: También se llama exéresis. Es la extirpación completa de un órgano o un tumor, generalmente sin márgenes, que se realiza en quirófano bajo anestesia general o local y con cirugía mayor o menor respectivamente.  Biopsia incisional: Es la biopsia en la que se corta o se extirpa quirúrgicamente sólo un trozo de tejido, masa o tumor. Este tipo de biopsia se utiliza más a menudo en los tumores de tejidos blandos como el cerebro, hígado, pulmón, riñón, para distinguir patología benigna de la maligna, porque estos órganos no se pueden extirpar, o porque la lesión es muy grande o difusa  Biopsia endoscópica : Es la obtenida por medio de un endoscopio que se inserta por un orificio natural o por una pequeña incisión quirúrgica, y que puede extirpar pequeños fragmentos de la superficie interna del órgano o cavidad.  Biopsia colposcópica: Es la biopsia en la que se obtiene tejido de la vagina o del cuello del útero y que realizan los ginecólogos ante una prueba de PAP positiva, para descartar un cáncer de cérvix o de vagina, mediante un colposcopio.  Punción-aspiración con aguja fina (PAAF) Es la biopsia obtenida mediante la punción con una aguja de escaso calibre conectada a una jeringa y la realización de una aspiración enérgica. Se obtiene generalmente células aisladas que se extienden sobre una laminilla. Más que una biopsia es una citología.  Biopsia por punción con aguja gruesa También se llama core biopsia o tru-cut que se realiza mediante la obtención de biopsia con pistolas automáticas, que reduce las molestias en el paciente. Una vez que se coloca la aguja en posición de predisparo, guiada por palpación o prueba de imagen, se presiona el disparador y la parte interior de la aguja, que es la que succiona el tejido, se proyecta atravesando la lesión y saliendo de ella con la muestra muy rápidamente. Precisa de anestesia local.

FIJACIÓN  Compleja serie de eventos químicos que son diferentes para los distintos grupos de sustancias que se encuentran en los tejidos.  La fijación es una reacción entre el fijador y la proteína manteniendo una relación lo mas parecida a su estado en vivo.  Toma unas 12 horas según el tamaño de la pieza y según el fijador.

FIJACIÓN OBJETIVOS  1. Prevenir el ataque de bacterias y la autolisis.  2. Mantener a los tejidos en volumen y forma durante el proceso.  3. Preparar los tejidos y dejarlo en una condición que permite la tinción de las secciones.  4. Dejar el tejido lo más cerca su estado de vida como sea posible impidiendo la pérdida de moléculas.  La principal función de los fijadores es insolubilizar las proteínas, ya que las mismas son las principales responsables de la estructura de las células.

FACTORES QUE AFECTAN LA FIJACIÓN  PH.  Temperatura.  La penetración del fijador.  El volumen de tejido.  De acuerdo con los factores anteriores, se puede determinar la concentración de fijador y el tiempo de fijación.

TIPOS DE FIJADORES  Ácido acético  Formaldehído  Etanol  Glutaraldehído  Metanol  Ácido pícrico.  Uno de los mejores fijadores para trabajos de rutina con el MO es el Formaldehído al 4% en solución tamponada (pH 7,5)  En el ME me utiliza una fijación doble con Glutaraldehído y solución tamponada de tetraóxido de osmio.

PROCESAMIENTO DE TEJIDOS  El objetivo del procesamiento de tejidos es la de insertar el tejido en un medio sólido suficiente para mantener el tejido y darle la suficiente rigidez para permitir el corte de secciones delgadas y además lo suficientemente suave para no dañar el cuchillo o el tejido.  Las etapas del procesamiento son:  1. Deshidratación  2. Aclaramiento  3. Inclusión  4. Corte

DESHIDRATACIÓN Y ACLARAMIENTO  Se extrae el agua de los tejidos pasándolos por baños de concentraciones crecientes de ETANOL, generalmente del 70% hasta etanol puro (100%).  Éste proceso toma de 6 a 24 hs según el tamaño de la pieza.  Luego el Etanol es sustituido por una sustancia miscible con el medio de inclusión.  Para la inclusión en parafina se utiliza XILOL o BENZOL para volver los tejidos translúcidos.

INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN  Se sumergen los tejidos en un medio apropiado (parafina o resina sintética).  La muestra se recubre con parafina fundida y se deja endurecer y enfriar para formar un bloque de parafina incluyendo al tejido.  Toma de 30 minutos a 6 horas según el tamaño de la pieza.

CORTE O SECCIÓN  El material de inclusión de los bloques de tejido se cortan mediante un MICRÓTOMO, que es un aparato equipado con una hoja y un brazo que desciende en el bloque el tejido en incrementos específicos. Para microscopía óptica el grosor fluctúa entre 6 y 8 μm.  También es posible realizar el corte en especímenes congelados, ya sea en nitrógeno líquido o en un porta muestras para congelación rápida en criostato.  Los cortes se estiran en agua caliente y se colocan luego en portaobjetos.

CORTE Y SECCIÓN

MONTAJE Y TINCIÓN  Los corten se montan en un portaobjetos con adhesivo y se tiñen, debido a sus diversas densidades, principalmente con colorantes hidrosolubles.  Los colorantes pueden agruparse en tres clases:  Los que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula.  Los que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular.  Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales en ellos.

TINCIÓN  La mayoría de los colorantes empleados en histología actúan como ácidos o bases.  Los componentes de los tejidos que se tiñen con colorantes BÁSICOS se denominan BASÓFILOS, y se tiñen de un color azul oscuro.  Los componentes que se tiñen con colorantes ÁCIDOS reciben el nombre de ÁCIDOFILOS.  Colorantes básicos: azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina. Tiñen los núcleos celulares por ser ricos en ADN y ARN.  Colorantes ácidos: naranja G, eosina y fucsina ácida. Tiñen el citoplasma rico en proteínas.  La doble tinción con HEMATOXILINA y EOSINA (HE) es la más utilizada de rutina.

COLORACIONES ESPECIALES  Tetróxido de osmio se utiliza en microscopía óptica para colorear lípidos.  Sudan se utiliza para destacar sustancias "sudanofílicas", por lo común, lípidos (determinar los niveles de grasa en materia fecal)  Fucsina ácida puede ser utilizada para colorear colágeno, músculo liso o mitocondrias.  Tinción de Papanicolau se utiliza para diferenciar células en muestras de secreciones biológicas (esputo, LCR, orina, etc.) y en raspados y biopsias. Permite distinguir con relativa facilidad células con transformaciones neoplásicas, levaduras y bacterias.

HISTOQUÍMICA E INMUNOHISTOQUÍMICA  La histoquímica es un método de tinción de tejidos que proporciona información sobre la presencia y localización de macromoléculas intracelulares y extracelulares.. Con frecuencia se efectúa en tejidos congelados y se aplica en cualquier microscopía. Se utiliza regularmente el reactivo ácido Peryódico Schiff (PAS).  INMUNOCITOQUÍMICA se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia (fluoresceína o rodamina) y antigenos para identificar una localización intracelular y extracelular de las macromoléculas más precisa de la que es posible con la histoquímica.

MICROSCOPIOS  Microscopia electrónica: El uso de electrones como fuente de luz en la microscopia electrónica permite lograr una ampliación y resolución mucho mayores que las obtenidas con la microscopia de luz. Se utiliza un haz de electrones en lugar de fotones como fuente de luz, el cual se amplía y enfoca por medio de electroimanes.  Microscopia electrónica de transmisión (MET) Se utilizan cortes más delgados para teñir los tejidos y se requieren técnicas de precipitado de metales pesados en lugar de colorantes hidrosolubles.  Microscopia electrónica de barrido Proporciona una imagen tridimensional del espécimen. Sólo se usa para observar superficies.

TRANQUILOS/AS QUE YA TERMINÓ..