Prueba de Hugh y Leifson (OF) Equipo 3B Cortes Domínguez Berenice Coutiño Romo Carla Alejandra

Fundamento Es una prueba que indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o fermentador (F). Se suele utilizar glucosa como sustrato. Las bacterias que respiran aerobiamente crecen en la superficie del medio del tubo abierto. Transforman la glucosa en CO2, la superficie del medio se verá ligeramente amarilla (por la formación de ácido carbónico originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio). En el tubo cerrado el cultivo se mantiene azul-verdoso. Las bacterias fermentadoras producen ácidos a partir de la glucosa. Viran el cultivo del tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el fondo, pero transcurridas 24 horas los ácidos pueden difundir por todo el medio virándolo a amarillo.

Medio de cultivo en el que se estudia El contenido de agar, da la propiedad de ser un medio semisólido, y permite determinar la movilidad y la distribución de los productos ácidos en el medio de cultivo. La glucosa es el hidrato de carbono mas frecuente que se agrega al medio basal O.F., pero también pueden agregarse otros azúcares, como ser, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol o xilosa, entre otros. La bacteria se inocula con el hilo recto (por picadura ) y se incuba en condiciones de aerobiosis (sin parafina) y de anaerobiosis (con parafina, tubo cerrado), simultáneamente.

Reacciones que ocurren y enzimas involucradas. Sustrato Se suele utilizar glucosa como sustrato. Fermentación: La molécula de glucosa es fosforilada primero y entonces es dividida en dos moléculas de triosa que experimentan cambios posteriores. (producen acidos) Oxidación: La molécula el grupo aldehído de la glucosa es oxidado a un grupo carboxilo formando ácido glucónico y CO₂

Oxidaciones posteriores pueden ocurrir para formar varios productos como el acido 2- cetoglucónico. No se ha detectado la fosforilación de la molécula de glucosa previa a su oxidación. La oxidación de carbohidratos es un proceso estrictamente aeróbico, mientras que la fermentación es un proceso anaeróbico.

Reactivo revelador o indicador Se detecta la acumulación de ácidos con un indicador ácido-base (azul de bromotimol).

Lectura e interpretación de la prueba Produce ácidos por: TUBO ABIERTO (O) TUBO CERRADO (F) Respiración Ligeramente amarillo en superficie Verde Fermentación Amarillo No produce ácidos Verdeo o azulado Verde o azulado

Microorganismos que se emplean como controles positivos y negativos Diferencia Micrococcus (solo produce ácidos aeróbicamente) de Staphylococcus (produce ácidos anaeróbicamente). Para diferenciar Pseudomonas (producción aeróbica de ácidos) de bacterias entéricas (producen ácidos anaeróbicamente).

La figura de la izquierda muestra el cultivo de tres bacterias: dos fermentadoras (izquierda y centro) y otra no fermentadora (derecha).