Metodos de purificación Basado en las siguientes propiedades proteicas: Tamaño Solubilidad Carga Adsorción Afinidad CAROLINA VITA

Procedimientos Tamaño Solubidad Polaridad Carga Característica   Procedimientos Tamaño Dialisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografia de exclusión molecular Ultracentrifufacion Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes organicos ‘’ por pH Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque Selectividad Cromatografia de afinidad

Cromatografias de exclusión molecular Separan por tamaño Las columnas rellenas polimeros inertes Insolubles pero muy hidratados Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

Exclusión molecular 1.La columna se equilibra con el buffer de corrida 2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna) 3. Elución. .                                                                                                                        

Exclusión molecular Separa mezclas de proteínas por tamaño De macromoléculas diferente De grandes estructuras celulares como ribosomas Determinación de PM

Volumen de exclusión Proteínas de gran tamaño no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión de la columna Vo

Determinacion de PM Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmula  r 2 x h Kav =Ve-Vo / Vt-Vo Kav Log Mw

CARGA Los grupos R en las proteínas globulares se encuentran sobre la superficie exterior de la molécula, aunque también pueden tener grupos ocultos o participando de puentes de H Carga  depende de las propiedades ácido – base de los grupos R

Cromatografía de intercambio iónico Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente. Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil (contraiones), estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz. La matriz generalmente es un compuesto inorgánico, resinas sintéticas o polisacáridos. Matriz Nombre Dextrano Sephadex Agarosa Sepharose CL-6B Celulosa Sephacel

Grupos cargados Son una propiedad fundamental del intercambiador. Determina el tipo y la fuerza del intercambiador El número total y su disponibilidad determinan la capacidad del intercambiador Los de carga negativa adsorben cationes mientras que los de carga positiva adsorben aniones. Así se llaman intercambiadores catiónicos y aniónicos respectivamente.

Cromatografía de intercambio iónico(IEX) Mecanismo de separación Separa a moléculas por carga neta. Grupos cargados unidos a la matriz adsorben muestras de carga opuesta(reversible) La desorción se logra a través el cambio del pH o aumentando la concentración de sal del eluyente.                                                                 Fig 1.1. las moléculas cargadas se absorben en los en los intercambiadores de carga opuesta. La interacción es un equilibrio dinámico que puede estar influenciado por pH como por la concentración de las sales.                                                                                               

Adsorción                                                                                                                                                                                                   Fig 1.2. El tamaño de la fecha representa la fuerza de la adsorción Proteínas poseen aa cargados en su superficie, se adsorben sobre el intercambiador Proteínas con carga neta negativa se absorben a I. catiónicos, La fuerza de adsorción aumenta con el aumento de carga neta. La carga de los aa depende del pH. la carga neta dependerá del pH de una manera que es bastante específica para cada proteína individual.

Desorción Reducir la carga neta cambiando el pH. Existen 2 posibilidades Reducir la carga neta cambiando el pH. Agregar un ión que compita por las cargas del intercambiador En IEX se utiliza una sal monovalente como NaCl, ya que tiene poco efecto sobre el pH de la corrida. Fig 1.3. A mayor carga neta, mayor es la adsorcion y mayor la concentracion de sales que se necesita para desorber la muestra                                                                                                                                                                                                             

Separación de proteínas usando gradiente de NaCl 1. El buffer se bombea por la columna hasta que la [salina] y el pH lleguen a un equilibrio 2. La muestra se aplica , se adsorbe y se lava con buffer 3. El gradiente comienza y los componentes adsorbidos de la muestra comienzan a eluir en función de su carga neta. Elution order:                          4. Regeneración de los componentes cargados hasta remoción completa.