Resistiendo el estrés oxidativo: La travesía de Trypanosoma cruzi a la infección

Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi Tomado de “The Trypanosoma cruzi Proteome” Atwood III et al; Science Vol 309; 2005

Respuesta inmune innata 1- Respuesta celular Activación de macrófagos residentes, células de Langerhans y NK Producción de interleuquinas proinflamatorias 2- Sistema del complemento Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

Rol central de los macrófagos en el control de la infección Fagocitosis como primera línea de defensa contra la infección por T. cruzi

Interacciones Macrófagos - T cruzi 2 O2 + NADPH  2 O2• – + NADP+ + H+ Rápida activación de la NADPH oxidasa durante la fagocitosis 8 min Villalta et al, 1984 Alvarez, MN et al, 2007

Óxido Nítrico Sintasa Actvadores: IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, productos derivados de patógenos (virales, bacterianos y de protozoarios) Inhibidores: IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β Interacción con células apoptóticas

- ONOO O2 RNH2 O2● _ H2O2 NO2¯ OH¯ OH● NO3¯ 2 H2O + Peróxido de Hidrógeno OH● Radical Hidroxilo H2O2 2 H2O O2 Especies Reactivas del Oxígeno NADPH oxidasa OH¯ SOD + 1e- O2● _ ● NO Óxido Nítrico NO2¯ Nitrito Dióxido de Nitrógeno ● NO2 NO3¯ Nitrato RNH2 L-Arginina - 1e- i NOS Especies Reactivas del Nitrógeno Peroxidasa/H2O2 (MPO) - 5e- Superóxido (anion radical) peroxinitrito ●NO2 + CO3●¯ ONOO ONOOH ●NO2 + OH● H+ CO2 ONOOCO2¯ -

Oxidantes intrafagosomales Macrófago no estimulado 2 hrs de infección

Oxidantes intrafagosomales Macrófago estimulado con IFN-ϒ 2 hrs de infección

Citotoxicidad de macrófagos contra Tripomastigotas rol del ONOO- en el control parasitario 20 40 60 80 100 Infección (%) Apocinina O2●- * +●NO Amastigotas intracelulares

Defensas Antioxidantes en T. cruzi

Las peroxiredoxinas de Trypanosoma cruzi tienen actividad peroxinitrito-oxidoreductasa in vitro (10 3 M-1s-1) (10 3 M-1s-1) NADPH TR ox T(SH)2 TXNox TcCPXRed ONOOH 10 6 M-1s-1 + NADP TR red TS2 TXNred TcCPXOx NO2- TR = tripanotiona reductasa T(SH)2= tripanotiona TXN = triparedoxina TcCPX= triparedoxina peroxidasa citosólica Trujillo et al, 2004

Resistencia de TcCPX a la citotoxicidad mediada por ONOO- Células Control Células Control + ONOO- TcCPX + ONOO-

Resistencia de cepa TcCPX 20 40 60 80 100 120 Infección (%) Tc CPX salvaje O2●- ONOO- * Infección en macrófagos In vitro Infección en ratones In vivo Días post-infección Tripomastigotas en 50 campos

Evaluación in vivo

Caracterización de las cepas TCC CL-WT

Contenido de Enzimas Antioxidantes TcCPX TcMPX TcTS Contenido relativo de enzima Epimastigotas de 3 días Tripomastigotas Metacíclicos Anticuerpos específicos

Enzimas antioxidantes: factores de virulencia Contenido relativo de enzima (tripomastigota metacíclico) Tripomastigotas en 100 campos Tripomastigotas en 100 campos

Respuesta inmune innata 1- Respuesta celular Activación de macrófagos residentes, células de Langerhans y NK Producción de interleuquinas proinflamatorias 2- Sistema del complemento Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

Muerte Celular Programada en T. cruzi Estímulo de muerte: suero humano fresco (SHF) CTL SHI SHF Control SHF Ctl SHF Tinción de núcleos apoptóticos Fragmentación ADN Exposición de fosfatidil-serina Activación del complemento sobre la superficie del parásito, Influjo de Ca2+ y disfunción mitocondrial Irigoín, F et al., 2009

O2- como mediador de la MCP Smith and Murphy, 2003 HE Mito-Hidroetidio (Mitosox) Detección de O2- mitocondrial en T. cruzi Dimetoxi naftoquinona (DMNQ)

O2- mitocondrial como mediador de la MCP Exposición a suero humano fresco MitoSOX oxidado Tinción nuclear

Protección de la MCP por Fe-SOD Sobreexpresión de la Fe-SODA Control TcSODA SHI SHF SHF SHI bp 2 O2• – + 2H+ O2 + H2O2 k = 109 M-1 s-1

Parásitos apoptóticos en el huesped vertebrado Infección in vitro Cardiomiocitos Infección in vivo Corazón(14 dpi) Macrófagos peritoneales Souza EM et al., 2003 Cell and Tissue Research.

Activación Clásica Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363

Activación Clásica Activación Alterna Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363

Determinantes de la eficiencia de la infección por Trypanosoma cruzi Establecimiento temprano de una respuesta proinflamatoria con inducción de la iNOS en macrófagos Niveles de enzimas antioxidantes en los tripomastigotas metacíclicos Presencia de parásitos apoptóticos en el inóculo infectivo

PERSPECTIVAS Búsqueda de inhibidores específicos que interfieran con la red antioxidante de Trypanosoma cruzi en vistas a un tratamiento coadyuvante Evaluación de la MCP en nidos de amastigotas dilucidando las señales que llevan a la inducción del proceso de muerte

Departamento de Bioquímica María Noel Alvarez Gonzalo Peluffo Florencia Irigoín Madia Trujillo Carlos Robello Rafael Radi Colaboración Internacional Shane Wilkinson Martin Taylor John Kelly Paola Zago Miguel Basombrio Howard Hughes Medical Institute PEDECIBA (Uruguay) CONICYT (Uruguay) PDT (Uruguay)