EVALUACIÓN DEL POTENCIAL BIOFERTILIZANTE DE TRES CONSORCIOS DE CIANOBACTERIAS EN EL CRECIMIENTO Y VALOR NUTRICIONAL DE PASTO RYEGRASS ANUAL (Lolium multiflorum) A NIVEL DE CÁMARA DE INVERNADERO

Formulación del Problema Salud humana *Agua contaminada con nitratos * La transformación de nitratos a nitritos desemboca en compuestos cancerígenos conocidas como Nitrosaminas (Suquilanda, 2003). Fertilizantes Químicos Uso de fertilizantes de forma desmesurada Perjuicios al suelo, la atmósfera y agua de consumo Ambiental Contaminación de acuíferos subterráneos por lixiviación Desbalance del ecosistema e infertilidad de suelos (Blanco, 1999). Reducción de la diversidad microbiana y nutrientes naturales del suelo (Sanchez & Mass, 2009)

Justificación del problema Aumento del rendimiento de las Pasturas Uso de fertilizantes que suplan el nitrógeno que demandan las plantas El uso continuo e inadecuado de químicos es más nocivo que beneficioso Implementación de biofertilizantes Mantener la fertilidad del suelo, promover los rendimientos de cultivos, cuidar el ambiente y reducir costos Uso de abonos orgánicos como fuente de vida bacteriana para e suelo y para la nutrición de las plantas (Anesín et al., 2003). Desarrrollo biotecnológico Producción Agraria Empleo de microorganismos fotosintéticos con capacidad para fijar nitrógeno atmosférico

Objetivos de la Investigación Objetivo general Evaluar el potencial biofertilizante de tres consorcios de cianobacterias en el crecimiento y valor nutricional de pasto Ryegrass annual (Lolium multiflorum) a nivel de cámara de invernadero.  

Objetivos específicos Obtener consorcios de cianobacterias a partir de diferentes muestras de suelo, biofilms y cortezas de árboles tomadas en las faldas del volcán Pasochoa. Producir biomasa en medio líquido a partir de consorcios de cianobacterias mantenidos en medio sólido. Preparar los biofertilizantes que serán empleados como tratamientos. Evaluar bajo biofertilización la evolución del crecimiento del Raygrass en masetas. Determinar la materia seca, humedad, proteína, fibra bruta, grasa y ceniza del Raygrass anual. Comprobar la sobreviviencia de cianobacterias en el Raygrass anual.

Hipótesis de la Investigación Hipótesis nula Los tres consorcios microbianos con cianobacterias presentan similares efectos fertilizantes en el Raygrass. Los consorcios microbianos con cianobacterias, como los fertilizantes orgánicos tienen el mismo efecto sobre las plántulas de Raygrass en crecimiento y valor nutricional. Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias tienen el mismo efecto que un fertilizante químico   Hipótesis alternativa  Los tres consorcios de cianobacterias presentan diferentes efectos sobre las plántulas de Raygrass. Los consorcios de cianobacterias y los fertilizantes orgánicos muestran diferentes efectos en el crecimiento y valor nutricional del Raygrass. Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias, no presentan el mismo efecto que los fertilizantes químicos.

Biofertilizantes Cianobacterias Producto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicos Su aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo. Favorece la aireación y oxigenación del suelo Son fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998). Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos Cianobacterias Procariotas fotosintéticos, su tamaño varía de 0,5 a 70um de diámetro, carece de núcleo y organelos Aislado de muestras ambientales, clínicas , animales y plantas. Amplia distribución desde climas fríos, tropicales hasta los más extremos En el área agrícola han sido empleadas como biofertilizante en forma libre y simbiosis Tienen la capacidad de llevar a cabo la diferenciación celular Generan celular especializadas (Heterocistos) donde se produce la fijación de nitrógeno mediada por la enzima nitrogenasa (luden, 2000).

Fijación biológica de Nitrógeno por cianobacterias Producto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicos Su aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo. Favorece la aireación y oxigenación del suelo Son fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998). Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos

Metodología Recolección de muestras Lupinus spp.

Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas % Humedad, Temperatura, Ph y Análisis Físico- Químico del Suelo Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas Decantación 90 ml y 95 ml Caldo Peptona 16 S 956 pb PAGS-F PAGS-R (Spilker et al, 2004) (+) CVP (Diluciones seriadas en caldo peptona) 10-1 10-4 0,1 ml Siembra Agar Cetrimida ETA 396 pb ETA 1 ETA 2 (Ashraf y Carl, 1994) Identificación Fenotípica de posibles cepas Pseudomonas aeruginosa Secuenciación amplicón 16SPseudomona aeruginosa y ETA Conteo UFC/g Cultivo Puros

1.- % Humedad, Temperatura (superficial, media y baja) y Secuenciación amplicón 16S Pseudomonas aeruginosa y ETA 1.- % Humedad, Temperatura (superficial, media y baja) y pH Identificación Fenotípica Tinción GRAM (-) Oxidasa (+) Identificación de pigmentos King A King B Pruebas Bioquímicas No fermentadores TSI O-F Medio Hugh Leifson Acetamida Reducción de Nitratos Gelatinasa Crecimiento a 4°C y 42°C. Control - 2 Identificación Genotípica DO260/DO280= 1,5 – 2 ng/uL= 5 MUESTREO MUESTREO 2.- Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas 90 ml y 95 ml Caldo Peptona PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PROCESAMIENTO DE MUESTRAS IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA Conteo UFC/g.s MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Extracción de ADN Cultivo Puros Decantación PCR 16s Pseudomonas aeruginosa IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA ETA 396 pb ETA 1 ETA 2 (Ashraf y Carl, 1994) 16 S 956 pb PAGS-F PAGS-R (Spilker et al, 2004) (+) P. aeruginosa Pseudomonas spp. 3.- Análisis Físico –Químico muestra compuesta por campo (500g) : 6 submuestras CVP (Diluciones seriadas en caldo peptona) 10-1 10-4 0,1 ml Siembra Agar Cetrimida 1 IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA 1 SECUENCIACIÓN Secuencia consenso

Resultados y Discusión 1.- Análisis Físico- Químico: FACTOR MICROBIOLÓGICO Figura 1 -2 . Densidad bacteriana de Pseudomonas spp (UFC/g.s) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

Tabla 2 Descripción de los lugares, campos, coordenadas geográficas e historia agrícola de los cultivos. Figura 3 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en las muestras de rizosfera y hoja de los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo. Figura 4 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

FACTORES FÍSICOS Figura 5. Factores Físicos: Clase Textural, Humedad(%) y Temperatura (°C) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

FACTORES QUÍMICOS 1.-pH 2.- % Materia orgánica Figura 6 Factores Químicos: pH y Materia Orgánica (MO %) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

FACTORES QUÍMICOS Figura 7 Elementos inorgánicos B, Na, Ca, Mn y Zn en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

Morfología de la colonia 2.- Caracterización fenotípicamente los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa Tabla 3 Características fenotípicas de posibles cepas de Pseudomonas aeruginosa encontradas en los campos muestreados. Cepa Comunidad Campo Muestra Morfología celular Morfología de la colonia Pigmentos Pioverdina Piocianina Piorrubina ATCC 10145 ______ Bacilos Gram Negativos B + 58SCR Cachapamba San José Cultivado Rizosfera A - 30PCCR Chaloapamba 26SCR 32PCH Hojas D 23SCR 47PPCR C 17CSSR Sacaguan Silvestre A: Colonias grandes de color crema, consistencia mucosa y halo amarillo verdoso B: Colonias grandes e irregulares con centro mucoso y halos azul verdoso - amarillo verdoso C: Colonias medianas transparentes con halos azul verdoso - amarillo verdoso D: Colonia mediana redonda y consistencia mucosa con halo amarillo verdoso

3.- Caracterización genotípicamente los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA Tabla 4 Aislados positivos a la amplificación del gen 16S y ETA mediante el ensayo de PCR.

Tabla 5. Frecuencia de Pseudomonas aeruginosa en campos cultivados y silvestres en Lupinus spp. Prueba de contraste de independencia de variables cualitativas Chi – cuadrado X2.

4.- Caracterización molecular de los amplicones los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA Tabla 6 Resultados de secuenciación del amplicón 16s DNAr y amplicón ETA

Conclusiones  Los suelos rizósfericos de Lupinus spp, presentaron características texturales de suelos arenosos; valores bajos de temperatura a excepción de la comunidad de Musuk Pacarí y bajos porcentajes de humedad.   Entre los factores químicos de los suelos rizósfericos estudiados, el pH dio valores neutros, característica asociada a los suelos arenosos. La variación de las cantidades de micronutrientes, Ca, Mn Na Zn y B está relacionado a los bajos valores de materia orgánica y baja capacidad de intercambio catiónico. La densidad bacteriana de Pseudomonas spp 103-5 UFC/g.s de los suelos Lupinus spp fue menor en comparación con otros estudios que reportan valores de 10 6-7 . La densidad bacteriana de Pseudomonas spp, fue significativamente diferente de acuerdo al tipo de muestras, existiendo una mayor cantidad en la rizosfera de las dos provincias.   

   La caracterización fenotípica permitió identificar siete posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa, sin embargo estos resultados presentaron ambigüedad en las pruebas de crecimiento a 42°C y utilización de acetamida. La caracterización molecular del los aislados que amplificaron el gen 16s DNAr de Pseudomonas aeruginosa y Exotoxina a través de PCR y secuenciación dieron como resultados tres aislados de P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR y 6 que poseen el fragmento de 396pb del gen ETA: 4 P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR, 42 y 2 P. fluorencens 11 y 19. La cantidad de aislamientos de Pseudomonas aeruginosa depende del tipo de campo encontrándose con mayor frecuencia en campos cultivados que silvestres, las zonas de donde se aisló P. aeruginosa corresponden a las comunidades de Cachapamba San José y Chaloapamba caracterizados por ser un terreno de pastoreo y uso de abono orgánico gallinaza con rotación de cultivos de papa y zanahoria respectivamente. La presencia de Pseudomonas aeruginosa en los campos cultivados permitieron advertir que la rizosfera es un potencial reservorio de este microorganismo. La presencia del gen ETA en los aislados de Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens presumió la trasferencia de genes de virulencia entre microorganismo habitantes de un mismo nicho ecológico.     

Recomendaciones Relacionar factores bioquímicos como respiración microbiana recuento de poblaciones microbianas, coeficiente metabólico e índices de mineralización para entender los cambios de parámetros microbiológicos calidad y salud del suelo.   cultivo de enriquecimiento como el caldo Acetamida que permita una selección previa de Pseudomonas aeruginosa. Observar los pigmentos después del tiempo de incubación a 37°C se coloque las cajas a temperatura ambiente durante 24 horas para una mejor visualizan de los pigmentos. Estudiar nuevas zonas geográficas donde se utilice sistemas de riego, abonos orgánicos.

A nivel molecular, realizar una identificación de otros factores de virulencia en Pseudomonas aeruginosa como Exoenzima S presentes en aislados ambientales y clínicos. Utilizar otro tipos de genes como marcadores taxonómicos en la identificación de P. aeruginosa. gyrB, exoA, y algD; y primers específicos diseñados para la amplificación y secuenciación (Osayande, et al., 2009) que podrían ser utilizados en futuros proyectos. Ensayos in vitro mediante la inoculación de cepas de Pseudomonas aeruginosa provenientes de muestras ambientales y clínicas donde hayan sido identificados factores de virulencia, para determinar y comparar el grado de virulencia de las diferentes P. aeruginosa y la respuesta del huésped. Se recomienda el control de la carga microbial en sistemas de riego y abonos de animales de granja así como un análisis microbiológico de los indicadores de calidad de agua y abonos orgánicos.