Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Iztacala Metodología Científica III “Evaluación de la absorción de metales pesados por fitorremediación en aguas residuales utilizando Amaranthus hybridus mediante un sistema de humedal”. Cruz Olmos Sandra Llamas Franco Yago S. Maldonado González Gabriel M. Noriega Hidalgo Roberto D. Verdín Flores Jessica S. Villegas Macedo Angélica Y.

AGUAS RESIDUALES Cuerpos de agua contaminados por heces fecales, orina y subproductos de la actividad humana ORGÁNICOS INORGÁNICOS 99.9% de agua y un 0.1% de sólidos N, P, cloruros, carbonatos, sulfuros y metales pesados (Fe, Cd, Cr, Cu, Hg o Zn) Tóxicos o venenosos Componentes Carcinógenos Estrés oxidativo

ESTRÉS OXIDATIVO Efecto tóxico por especies químicas altamente reactivas producidas durante la reducción del oxígeno molecular en los organismos aerobios, que pueden ser o no radicales libres Causa: inactivación de enzimas blanqueo de pigmentos peroxidación de lípidos degradación de proteínas

USO DEL AGUA En México, una de las grandes problemáticas es la disponibilidad y contaminación y demanda en los usos del agua. Tratamiento de aguas residuales Los costos elevados, tratamiento y conducción al lugar de rehúso Alternativa factible: FITOREMEDIACIÓN

Hiperacumuladoras de MP FITOREMEDIACIÓN Plantas como filtros biológicos Hiperacumuladoras de MP Suelo Agua (utilizando humedales) Fijándolos a Remover Transferir Estabilizar Concentrar Destruir los contaminantes Raíces Tallos Fitoextracción Rizofiltración

Actualmente se conocen 400 especies repartidas en 45 familias , siendo la familia Brassicaceae y Fabaceae las que cuentan con más especies hiperacumuladoras. Amaranthus retroflexus es capaz de acumular cesio 137, el cual es radiactivo y muy peligroso. Helianthus annuus es capaz de absorber grandes cantidades de uranio del suelo. Arabidopsis thaliana es capaz de acumular cobre y zinc en grandes cantidades.

Amaranthus hybridus L. Es una especie de la familia de las Amaranthaceae, originaria de México la cual está considerada como una maleza de follaje comestible. Esta planta es altamente competitiva, presentando como rasgo más llamativo el ser hiperacumuladora.

Humedales artificiales Los HA se definen como sistemas que simulan una zona de transición entre el ambiente terrestre y el acuático, pero que son específicamente construidos para el tratamiento de aguas residuales bajo condiciones controladas de ubicación, dimensionamiento y capacidad de tratamiento.

ANTECEDENTES Autores Estudio Resultado Fan y Zhou (2009) Estudiaron la capacidad hiperacumuladora de Amaranthus mangostanus L. Reportaron al Amaranthus mangostanus L. como planta hiperacumuladora de cadmio. (Ortega, et. al., 2008) Se evaluó la capacidad de Amaranthus retroflexus de absorber y acumular cesio 137 en comparación con otras plantas del mismo género. 40 veces más efectiva que sus competidoras en absorber cesio 137, (Ortiz-Cano, et. al., 2009) Estudiaron la capacidad extractora de Plomo (Pb) y Cadmio (Cd) de Amaranthus hybridus L. al adicionarle una mezcla de micorrizas arbusculares Se encontró que las concentraciones de estos metales se incrementaron significativamente conforme la edad de la planta.

Objetivos GENERAL Evaluar la absorción de metales pesados en Amaranthus hybridus. PARTICULARES Cuantificar la absorción de plomo y cadmio en raíz y parte aérea. Evaluar el estrés oxidativo causado por las aguas residuales en Amaranthus hybridus. Evaluar la calidad del agua residual por tratamiento con humedales

Materiales y método Análisis del agua Se medirá la aptitud para transmitir la corriente eléctrica por medio de un conductímetro. Se determinará el pH utilizando un pH-metro con soluciones buffer de pH 4.00 y 7.00 para calibrarlo. El residuo seco se determinará mediante la evaporación de 100ml de agua residual en estufa a 105°C. Los metales pesados se determinaran por espectrofotometría de absorción atómica.

Determinación del oxígeno disuelto (OD) del agua. Botella de 500 ml llena Se añadirá 0.1 ml de solución MnSO4 y 0.5 ml de solución azida-iodo. Se agitara, posteriormente se agregara 0.5 ml de H2SO4 concentrado Se valorará con tiosulfato 0.01M (color paja pálido) Se añadirá gotas de solución de almidón (color azul)

Demanda biológica de oxígeno Se realizará por la técnica de DBO de 5 días, que consiste en llenar un frasco con muestra cerrado a temperatura establecida por 5 días. Al inicio y al final de la prueba se medirá el OD. La DBO se determina mediante la diferencia entre el OD inicial y el final.

Material Vegetal Grupo tratado con agua potable + solución nutricional Amaranthus spp se obtendrá de los invernaderos de Xochimilco Se trasplantarán en un humedal de flujo horizontal Adaptación de 15 días Se dividirán en 3 grupos Grupo tratado con agua potable + solución nutricional Grupo tratado con aguas residuales Grupo tratado con agua potable + altas [ ] de Cd y Pb

Determinación de Metales pesados en el material vegetal Parte subterránea Parte aérea Se digerirá con una mezcla HCl: HNO3: HClO4 (5:3:2). Se cuantificaran los metales pesados por la técnica de Espectrofotometría de absorción atómica.

Cuantificación de clorofilas y Carotenoides Homogeneizado 0,1 g de peso fresco de la planta en 10 ml de acetona al 80% por 2 min en oscuridad. Se centrifugara a 3000 rpm durante 15 minutos en tubos protegidos de la luz. 0,2 ml del sobrenadante + 2 ml de acetona al 80% y se agitara.   La concentración de clorofilas : fórmulas de Lichtenthaler para acetona al 80%. Medición absorbancia a 663 (Ch a), 646 (Ch b) y 470 nm (carotenoides), empleándose como blanco la acetona al 80%

DETERMINACIÓN PERÓXIDO 500 mg de hoja Homogeneizar en frío TCA 0.1% centrifugar y 1000 rpm por 15 min Tomar 0.5 sobrenadante añadirle posteriormente Medir absorbancia a 390 nm. 0.5 buffer fosfatos 10mM pH 7.0 y 1mL de KI Por último Realizar cálculos con Curva estándar

EXTRACCIÓN PEROXIDASA Macerar 0.1 g Extracción enzimática con 2mL de un buffer de fosfatos 50mM pH 7.8 0.1 mM de EDTA y posteriormente Se centrifugará a 10,000 rpm por 20 min. 1% de PVPP

CUANTIFICACIÓN DE PEROXIDASA 200µL mezcla de reactivos (440µL guaiacol 0.05% y 10mM H2O2) 20 μL Extracto crudo y Temperatura ambiente Se incubara durante 10 minutos posteriormente Se medirá absorbancia a 450 nm

ACTIVIDAD ENZIMATICA CATALASA Extracción enzimática Utilizaran 0.5 g. de hojas con y 5 ml. de buffer fosfatos con pH7 50mg. de polivinilpirridiona luego posteriormente Se centrifugará a 11,000 rpm por 11 min. Macerar a 4°C Por ultimo Se tomará el sobrenadante

CUANTIFICACIÓN DE CATALASA Se prepararan 5 ml. de la mezcla de reacción 300µM. De buffer fosfatos con pH 6.8 que contiene también Se agregara 1 ml. de la enzima diluido 1:20 (v/v) 100 µM H2O2 Por ultimo posteriormente Se incubara a por 1min. A temperatura constante a 25°C Detener la reacción se agregara 10 ml de H2SO4 al 2 % (v/v) Titular el H2O2 para para Fue con Obtener una coloración purpura que dure al menos 15 s. Una solución de KMnO4 (0.2 M) hasta

Cuantificación de carbohidratos Preparación de las muestras: Se recolectarán muestras de los humedales antes de iniciar el tratamiento, durante la segunda semana, y al finalizar el tratamiento. 1g de hojas y 1g de raíz 10 ml de etanol al 80% Ebullir por 10 minutos Aforar a 10 ml

Azúcares reductores por el método de Nelson Somogy 1 2 3 4 5 6 7 Patrón de glucosa 200µg/ml (ml) 0.25 0.50 0.75 Agua destilada (ml) Reactivo de cobre (ml) Se calentará en baño maría 20 minutos. Se dejará enfriar. Arsenomolibdato (ml) Se ajustara el volumen a 10 ml con agua destilada Se mezclará por inversión Absorbancia a 540 nm

Cuantificación de almidón por método de Antrona 1 2 3 4 5 6 7 8 Patrón de almidón (10mg/100ml) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Filtrado de Ácido perclórico 0.125 Agua destilada 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.375 Antrona 2.5 Se agitará por inversión. Se calentará en baño maría por 11 minutos. Se enfriará en hielo y se leerá la absorbancia a 630 nm

Azucares totales por el método de Antrona 1 2 3 4 5 6 7 Patrón de glucosa (200µg/ml) 0.062 0.125 0.25 0.375 Extracto problema 0.5 Agua destilada 1.25 1.187 1.125 0.875 0.75 Antrona 2.5 Se agitará por inversión Se calentará en baño maría por 110minutos Se leerá la absorbancia a 630 nm.

Cuantificación de fitoquelatinas 5 g de la muestra se macerará y se lavará con 150ml solución EDTA/Pb en relación molar 12. Reposarán con 10 ml de HNO3 por una noche. Se cuantificarán las fitoquelatinas y metalotioninas por la técnica de espectrofotómetría de absorción atómica. Posteriormente se digerirán a 150° C por 60 minutos hasta la desaparición de vapores pardos.

GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!