AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN Enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificación. CAROLINA VITA

MÉTODOS DE ESTIMACIÓN - UNIDADES El 1º requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad Para decidir si es conveniente un paso de purificación, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y después de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles.

Naturaleza del ensayo Dependerá del tipo de reacción que cataliza la enzima. Resultará conveniente la medición de la aparición de un producto o la medición de la desaparición de sustrato. La actividad de una enzima depende de condiciones tales como T, pH, concentración; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades.

Elección del sustrato Es muy importante: barato de fácil determinación estable no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentración saturante así la velocidad es independiente de la [sustrato] y proporcional a la cantidad de enzima.

Unidad enzimática Se define en forma particular para cada reacción según sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formación de una determinada cantidad de producto (o desaparición de reactivo) en un tiempo dado en determinadas condiciones de reacción.

Actividad específica La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica (Ae) Actividad específica es el cociente de actividad enzimática (expresada en unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas. Ae = Actividad enzimática Proteínas totales

ANÁLISIS DE LOS DATOS Para juzgar si un método de purificación es adecuado, deben calcularse: recuperación y el grado de purificación alcanzados.

Las unidades enzimáticas totales de la etapa inicial (100%) puede calcularse el rendimiento de cada etapa refiriendo las unidades totales de cada paso a las iniciales. Grado de purificación, debe obtenerse primero el valor de Ae alcanzado en cada paso. Si se considera la Ae inicial como unidad de purificación, el grado de purificación de cada etapa se calcula haciendo el cociente entre la Ae de dicha etapa y la del primer paso.

CRITERIOS DE HOMOGENEIDAD Cuando una purificación enzimática ha alcanzado la etapa donde posteriores purificaciones o pasos no producen un incremento en la actividad específica, pueden investigarse con métodos analíticos la homogeneidad y pureza de la preparación obtenida. Pueden utilizarse métodos cromatográficos, electroforesis, isoeléctroenfoque La obtención de un único pico proteico es indicativo de homogeneidad, si esto ha sido comprobado por varios métodos.

Monitoreo del proceso de purificación AE Unidades totales en la fracción i Total de proteínas en la fracción i Rendimiento Unidades totales en la fracción original Porcentaje de purificación AE en la fracción i AE en la fracción original