CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO ANTISEPSIA: eliminación de microorganismos patógenos de tejidos vivos. DESINFECCION: eliminación de microorganismos patógenos de objetos inanimados ESTERILIZACIÓN: eliminación por separación o muerte de todo microorganismo viable de un objeto.

Bacteriostático Bactericida Bacteriolítico

Factores que afectan el control de los microorganismos Curva de muerte Factores que afectan el control de los microorganismos El número de microorganismos El tiempo de exposición La concentración del agente de control El tipo de microorganismos El estado físico de el microorganismo Condiciones ambientales locales La temperatura

Efecto de la concentración del agente de control Logaritmo de los supervivientes por ml 6,04 mg/l 4,62 mg/l 4,25 mg/l 3,48 mg/l 3,76 mg/l 3,96 mg/l Tiempo (minutos) Efecto de diferentes concentraciones de fenol sobre una población de E.coli

ESTERILIZACION POR CALOR Cinética de esterilización por calor (K): Nº de microorganismos viables/tiempo Tiempo de reducción decimal: D Valor Z: Mide el cambio en la tasa de destrucción térmica en relación con el cambio en la temperatura.

Valores D y z para microorganismos patógenos asociados a alimentos Microorganismo Substrato D (°C) Minutos z (°C) Clostridium botulinum buffer fosfato D121 = 0.204 10 Clostridium perfringens Medio de cultivo D90 = 3–5 6–8 (cepa resistente al calor) Salmonella Pollo D60 = 0.39–0.40 4.9–5.1 Staphylococcus aureus Pollo D60 = 5.17–5.37 5.2–5.8 Pavo D60 = 15.4 6.8 0.5% NaCl D60 = 2.0–2.5 5.6

La naturaleza del microorganismo Desinfección por UV http://www.cepis.ops-oms.org/eswww/fulltext/aguabas/ultravio/ultravio.html

Condiciones Ambientales El calor es más eficaz en un medio ácido que en uno alcalino. La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetración del agente. Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia térmica de los organismos.

La presencia de materia orgánica extraña reduce notablemente la eficacia de los agentes antimicrobianos No permite que el agente llegue a los microorganismos Se combina con el desinfectante y lo precipita Se combina con el desinfectante y lo inactiva dejando libres concentraciones tan bajas que no logran el efecto deseado sobre la población microbiana

La temperatura Logaritmo de los supervivientes por ml 42°C 38°C 35°C 30°C 32.5°C Tiempo Efecto de la temperatura en el control de E.coli con fenol a una concentración de 4,62 g/l

Métodos de esterilización Calor Agentes químicos Radiaciones Filtración

Las esporas de Clostridium botulinum son destruidas: CALOR Esterilización por calor húmedo: Sobrepresión Tindalización Esterilización por calor seco: Horno Incineración Las esporas de Clostridium botulinum son destruidas: En 4 a 20 minutos a 120° C en calor húmedo En 2 horas de exposición al calor seco.

Calor Húmedo Autoclave

La esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima en el interior del aparato (autoclave o estufa) Según el contenido, un autoclave puede requerir tiempos más largos para alcanzar la temperatura de esterilización. Cuando el log del número de sobrevivientes es menor a cero se habla de probabilidad de sobrevivencia. Por lo tanto cuando el valor de la probabilidad sea -1 significa que hay 0.1 microorganismos viables por unidad, o correctamente expresado una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas. Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades contaminadas es menor o igual a 10-6, esto es una unidad contaminada cada millón de unidades idénticas procesadas. A mayor número de microorganismos y/o resistencia de la población se necesitará mayor tiempo de esterilización, o lo que es lo mismo mayor tiempo para alcanzar la probabilidad de sobrevivencia. Durante el proceso de esterilización por calor debe tenerse en cuenta que el tiempo de esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima en el interior del aparato (autoclave o estufa) y que generalmente el contenido de un autoclave puede requerir tiempos más largos para alcanzar la temperatura de esterilización.

No se deben esterilizar en el autoclave: Sustancias que no se mezclan con el agua porque no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microorganismos que contengan. Sustancias que se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor.

Pasteurización: reducción de la población microbiana (eliminación de microorganismos patógenos). Alimentos Tipos de pasteurización: - BAJA: 62 - 68ºC 30 minutos Proceso discontinuo, volúmenes pequeños, envasados. - ALTA o H.T.S.T. (high temperature, short time): 72 - 90ºC 15 - 30 segundos RELÁMPAGO (“flash”): 88 - 97 ºC 1 - 12 segundos Sistemas de flujo continuo con intercambiadores de calor

Tindalización Calentamiento del material de 80 a 100° C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos períodos de incubación. Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por encima de 100° C sin que resulten dañadas. Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de incubación y en la siguiente exposición al calor las células vegetativas son destruidas.

Calor Seco Horno Incineración La esterilización seca se logra a 160-170 °C por 2-3 hrs. El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposición a 160° C. Incineración La destrucción de los microorganismos por combustión o cremación. En los laboratorios, las ansas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineración también se utiliza en la eliminación de residuos hospitalarios.

Radiaciones Radiaciones ionizantes Rayos gamma Rayos catódicos Radiaciones no ionizantes Luz ultravioleta

Rayos gamma Rayos catódicos Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por ciertos isótopos radiactivos como es el Co60. Son difíciles de controlar porque este isótopo emite constantemente los rayos en todas direcciones. Estos rayos pueden penetrar materiales, por lo que un producto se puede empaquetar primero y después esterilizar. Rayos catódicos Radiación con haz de electrones Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros materiales. Ventaja: el material se puede esterilizar después de empacado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente.

Dosis de radiación absorbida: 1rad = 100erg/g 100 rad = 1Gray (Gy) Especie biológica D (Gy) Clostridium botulinum (G+, esp., anaerob.) 3300 Bacillus subtilis (G+, esp., aerob.) 600 Salmonella (G-) 200 Lactobacillus (G+) 1200 Deinoccocus radiodurans 2200 Aspergillus (hongo) 500 Saccharomyces (levadura) Fig. 1. Fracción de supervivencia celular (%) de la cepa D7 de S. cerevisiae frente a radiación gamma. Dosis letal para humanos: 10 Gy

Luz ultravioleta Radiaciones con longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruídos. Se usan para reducir la población microbiana en: Quirófanos Cuartos de llenado asépticos en la industria farmacéutica Superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. Bodegas de carne refrigeradas

Eliminación de microorganismos por separación: FILTRACION

La filtración se utiliza para Emulsiones oleosas, aceites, algunos tipos de pomadas. soluciones termolábiles: líquidos biológicos (suero de animales), soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos. Esterilizar soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

H.E.P.A / U.L.P.A.: Los filtros H.E.P.A (High efficiency Particulate Air) son filtros descartables de medio filtrante seco y extendido. Eficiencia mínima de 99,97 %: (penetración máxima del 0,03 %) en aerosoles de 0,3 micrones generados térmicamente (Norma MILSTD-282). Los filtros U.L.P.A. (Ultra Low Penetration Air) son filtros con características similares a los filtros H.E.P.A. Eficiencia mínima de 99,999 % (penetración máxima inferior al 0,001 %) para partículas de un tamaño entre 0,1 y 0,2 micrones. Se utilizan en sectores hospitalario, industria farmacéutica, industria alimenticia, industria química, industria veterinaria, cabinas de pintura, etc.

Agentes desinfectantes

Conservación En general, el metabolismo de las bacterias se inhibe a temperaturas por debajo de 0° C. No matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo. Circunstancia aprovechada por los microbiólogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.

Unidad 2: Crecimiento y metabolismo de los microorganismos   2.1.             Nutrición: fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno. Fuentes de fósforo y azufre. Factores de crecimiento. Clasificación de microorganismos sobre la base de los requerimientos nutricionales. Mecanismos de absorción de nutrientes. Medios de cultivo definidos y complejos. Sólidos y líquidos. Inoculación de medios, características de desarrollo en diferentes medios. Obtención de cultivos puros. 2.2.               Curva de crecimiento: fases de la curva. Métodos de medida del crecimiento bacteriano, medida del incremento de masa y número. Crecimiento exponencial, aritmético y diauxico. Crecimiento continuo, turbidostato y quimiostato. Crecimiento sincronizado.  Influencia de parámetros extrínsecos e intrínsecos sobre cada etapa del crecimiento bacteriano, mecanismo molecular de cada uno (pH y ácidos, temperatura, concentración de sustrato, actividad acuosa, concentración de oxígeno, presión, radiaciones), Clasificación de microorganismos sobre la base de los requerimientos de factores intrínsecos y extrínsecos. 2.3 Metabolismo microbiano:  Conversión de energía: conversión de la glucosa  en piruvato, glicólisis, vía de las pentosas, vía de Entner-Doudoroff. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Fosforilación oxidativa. Fermentación y fosforilación a nivel de sustrato. Respiración anaeróbia. Catabolismo de glúcidos, lípidos y  aminoácidos. Fotosíntesis. Utilización de energía y biosíntesis:  fijación fotosintética de carbono, fijación de nitrógeno, azufre y fósforo. Biosíntesis de aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas, lípidos y peptidoglicano. Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas:  replicación, transducción y traducción. Regulación  de transcripción, traducción y actividad enzimática. Control del ciclo celular. 2.3.            Trabajos experimentales y seminarios: -      Preparación y esterilización de medios de cultivo.  Siembras.      -            Curva de crecimiento bacteriano por turbidez a distintas   temperaturas y en diferentes medios. Recuento de bacterias viables (recuento de colonias y NMP). -           Métodos de preservación de cepas (congelación y liofilización).

NUTRICIÓN MICROBIANA microorganismo Agua 80-90% Peso seco 10% Hidrógeno, 8% Oxígeno, 20% Carbono, 50% Nitrógeno, 14% Fósforo, 3% Azufre, 1% 95% K Na Mg Ca Fe *** Mn Co Cu Mo Zn 5%

Requerimientos de Carbono Energía Categoría Luz Fotoautótrofo CO2 Quimioautótrofo Compuestos inorgánicos H2, H2S, Fe++, NH4+ … Quimioheterótrofo Compuesto orgánico C Compuesto orgánico Luz Fotoheterótrofo

NO3- NH4+, N2 SO4-2 Cys, Met PO4-3 Requerimientos de N, S y P Requerimientos de K, Mg, Ca - Na Sideróforos Requerimiento de Fe++ Micronutrientes o elementos trazas Factores de Crecimiento: Aminoácidos, Purinas y Pirimidinas, Vitaminas

Sintéticos: tienen una composición química Complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal,las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. Medios de cultivo Sintéticos: tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en: Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular, permitiendo aumentar su número. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar. Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Medios diferenciales: son medios sólidos que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos y/o inhibidores de crecimiento tal que permiten diferenciar el desarrollo de microorganismos diferentes.

Requerimientos de O2 Aerobios estrictos I- Anaerobios obligados (CO2 5-10%) A. o. estrictos (0.03% O2) o. moderados (2-8% O2) II- Anaerobios aerotolerantes Anaerobios Anaerobios facultativos Microaerófilos, O2 como aceptor final de e- en concentración < 21%