Química Biológica I - Bioquímica I Ácidos Nucleicos: desnaturalización, curvas Cot, métodos de purificación, cuantificación y secuenciamiento

Desnaturalización del DNA

Purificación de ácidos nucleicos Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Purificación de ácidos nucleicos

Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

Lisis de las células y solubilización del ADN Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Purificación de ADN : Lisis de las células y solubilización del ADN Aplicación de métodos enzimáticos y/o químicos que remuevan proteínas, ARN y otras macromoléculas

Plásmidos Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Plásmidos

ADN total Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata ADN total

PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Pasos fundamentales en la purificación Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Purificación de RNA Pasos fundamentales en la purificación  efectiva disrupción de células o tejido  desnaturalización de complejos nucleoproteicos  inactivación de la ribonucleasa (RNAasa) endógena  purificación del RNA de DNA y proteínas contaminantes El principal problema en la purificación es que el RNA es muy susceptible a la degradación. Todos los métodos de purificación emplean agentes desnaturalizantes de la RNAasa Métodos más utilizados:  4 M tiocianato de guanidinio  fenol y SDS (plantas)  combinación de ambos

ARN Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata ARN

electrophoresis resolves DNA fragments of different size

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Visualization of restriction fragments separated by gel electrophoresis

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7.1 Restriction enzymes cut DNA molecules at specific sequences Figure 7-5a

7.1 Restriction enzymes cut DNA molecules at specific sequences Figure 7-5b

7.1 Selected restriction enzymes

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7.3 Pulsed-field gel electrophoresis separates large DNA molecules Figure 7-26

Identifying, analyzing, and sequencing DNA

Analyzing specific nucleic acids in complex mixtures

7.5 Southern blotting detects specific DNA fragments Figure 7-32

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Sondas Marcadas radioctivamente Instituto de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Sondas Marcadas radioctivamente Marcadas no radioctivamente ( Digoxigenina, avidina) Se pueden obtener por: Sintesis química Extensión usando usando primers al azar PCR

Oligonucleotide probes are designed based on partial protein sequences

7.5 Northern blotting detects specific mRNAs Figure 7-33

The membrane-hybridization assay Double stranded DNA Melt Single-stranded DNA DNA binds to filter Filter Incubate with labeled DNA Hybridized complemetary DNAs Wash away labeled DNA that did not hybridize to DAN bound to filter Figure 7-17 Perform autoradiography

Identification of a specific clone from a  phage library by membrane hybridization

Secuenciación de DNA

- Método Químico (Maxam & Gilbert) - Método Enzimático (Sanger) a) Manual b) Automático

7.3 DNA sequencing: the Maxam-Gilbert method Figure 7-27

Método Enzimático (Sanger)

Secuenciación automática de DNA

7.4 Bioinformatics Bioinformatics is the rapidly developing area of computer science devoted to collecting, organizing, and analyzing DNA and protein sequences Using searches based on homologous sequences, stored sequences suggest functions of newly identified genes and proteins Homologous proteins involved in genetic information processing are widely distributed

7.4 Comparative analysis of genomes reveals much about an organism’s biology

7.4 The C. elegans genome encodes numerous proteins specific to multicellular organisms