PTEN en cáncer de mama Pablo Cerezuela Adjunto Oncología Médica. Hospital Universitario Santa María del Rosell. Cartagena

Terapia Molecular del Cáncer Siglo XX Siglo XXI Futuro ?????? Quimioterapia citotóxica Radioterapia Cirugía Diagnóstico molecular Terapia dirigida Terapia específica de cada paciente

RECEPTORES ErbB Ligandos ErbB-1 Her1 EGFR ErbB-2 Her2 ErbB-3 Her3 TGFa Anfirregulina b-celulina HB-EGF Epirregulina NRG-1 NRG-2 NRG-3 NRG-4 β-celulina Ligandos NRG-1 NRG-2 EC Unión del ligando IC Tirosincinasa C-terminal ErbB-1 Her1 EGFR ErbB-2 Her2 ErbB-3 Her3 ErbB-4 Her4

Mecanismos de Activación de HER2 Homodimerización (HER2 3+) Requiere sobre-expresión de HER2 No precisa ligando Heterodimerización (HER2 1/2 +) No requiere sobre-expresión de HER2 Depende de ligando TGF TGF K Receptor sin ligando K K K K K K K K K K pY pY EGFR EGFR/HER2 pY pY pY pY pY pY heregulin K pY X heregulin pY X HER2/HER2 HER2 HER3 HER3/EGFR Albanell J. et al. Adv Exp Med Biol. 2003;532:253-68.

Proceso de activación del receptor Ligand P P Degradation or reexpression Signal transduction through the ErbB receptors proceeds through an ordered, multistep process.1 The first step requires expression of the receptor on the cell surface as well as expression of the appropriate ligand, either by the same cell or by a neighboring cell. When both ligand and receptor are in close proximity, binding can occur. Interaction of ligand with the receptor causes receptor pairing, or dimerization. This interaction can occur between 2 of the same receptor (homodimerization) or between 2 different ErbB family members (heterodimerization). Receptor dimerization leads to activation of the intrinsic tyrosine kinase activity of the receptors, which results in transphosphorylation of the cytoplasmic tails, creating docking sites for downstream signaling molecules. 5. The interaction of downstream signaling molecules with the receptor tails leads to the formation of a signaling complex. This triggers additional phosphorylation events and sets off a signaling cascade that activates downstream pathways including MAPK/ERK and PI3K/Akt, producing outcomes such as cell-cycle progression, proliferation, and survival. 6. Activation of the ErbB receptors also triggers receptor internalization in a process that involves endocytosis in clathrin-coated pits. 7. Internalized receptors are either degraded within endosomal compartments, or recycled and returned to the cell surface. Sorting is based primarily on dimer composition. Homo- or heterodimers containing ErbB-1 are generally targeted for degradation, those containing ErbB3 are recycled, and those containing ErbB2 experience slower rates of endocytosis and increased recycling to the cell surface. The sorting process involves the ubiquitin ligase c-Cbl, which preferentially polyubiquitinates ErbB1 homodimers targeted for degradation within the lysosomal compartment. 1. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2:127-37. Clathrin pit Cell-cycle progression P P Survival Proliferation

Vías de señalización de ErbB Ras Grb2 Sos Grb2 Shc Sos Raf PI3K PI3K: Fosfatidil-inositol 3 kinasa Ligand-mediated dimerization of the ErbB receptors and subsequent autophosphorylation or transphosphorylation leads to their association with a variety of cytoplasmic phosphotyrosine binding proteins. This results in the initiation of a phosphorylation cascade and activation of several downstream pathways involved in cell growth and survival, including the Ras/Raf/MAPK and PI3K/Akt pathways.1 Stimulation of these pathways transmits a signal to the nucleus resulting in modification of gene transcription patterns that ultimately affects processes such as cell division, apoptosis, adhesion, migration, and/or differentiation. Although the various dimer combinations activate overlapping downstream pathways, each receptor exhibits a unique phosphorylation pattern. The profile of the adaptor proteins that interact with each family member, and thus the quality and potency of the output signal, is distinct. For example, Erb-B-3 contains 6 binding sites for a PI3K subunit, leading to particularly potent activation of the Akt survival pathway through dimers containing this receptor.2 In addition, the same receptor can also exhibit a different phosphorylation pattern and bind a unique subset of adaptor proteins dependent on ligand and dimerization partner. To illustrate, while EGF-activated ErbB1 homodimers recruit Shc and Grb2 and display rapid internalization, ErbB-1/ErbB-4 heterodimers activated by NRG-1 recruit Shc but not Grb2 and internalize more slowly.3 This combinatorial diversity allows for exquisite control and fine tuning of signal transmission and cellular responses through the ErbB family of receptors. 1. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2:127-37. 2. Prigent SA, Gullick WJ. Identification of c-erbB-3 binding sites for phosphatidylinositol 3′-kinase and SHC using an EGF receptor/c-erbB-3 chimera. EMBO J 1994; 13:2831-41. 3. Olayioye MA, Graus-Porta D, Beerli RR, et al. ErbB-1 and ErbB-2 acquire distinct signaling properties dependent upon their dimerization partner. Mol Cell Biol 1998; 18:5042-51. Akt PTEN MEK1/2 mTOR FKHR p27 GSK3 BAD MAPK Cyclin D1, E Supervivencia Proliferación Progresión del ciclo celular

PTEN PTEN (homólogo de la fosfatasa y la tensina) es un GEN SUPRESOR DE TUMORES que se encuentra reducido, mutado o eliminado en diversos cánceres humanos: próstata, mama, endometrio, tiroides, riñón y cerebro. El gen PTEN codifica un lípido doble y la tirosina fosfatasa que regula la vía PI3K/Akt mediante la desfosforilación del lípido de la membrana plasmática PIP3 (fosfatidil inositol 3, 4,5-trifosfato) que da lugar a la forma inactivada PIP2.

Activación de PI3K y Ras/MEK/Erk en cáncer de mama TN PIP2 PTEN

PTEN El papel principal de PTEN, relacionado con su actividad fosfatasa, es regular negativamente la vía PI3K/Akt, que condiciona la supervivencia celular. El efecto principal de la pérdida de PTEN parece ser un aumento de la proliferación y una disminución de la apoptosis. PTEN regula también la estabilidad de la proteína p53, lo que puede hacer pensar que una pérdida combinada de ambos supresores tumorales es necesaria para un efecto tumorigénico máximo.

PTEN En cáncer de próstata la pérdida completa de la expresión de PTEN se correlaciona con CPHR y es responsable de las MTS, en particular parece ser que puede facilitar las MTS óseas. La pérdida completa de la expresión de PTEN podría servir como marcador pronóstico precoz de MTS en cáncer de próstata. En células de cáncer de mama las concentraciones de la proteína 2 de unión al factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP-2) son elevadas y pueden suprimir PTEN.

PTEN Existen también alteraciones de PTEN en cáncer de endometrio, observándose que cuando se asocia a deficiencias en los mecanismos de reparación de ADN, se acelera la formación del cáncer de endometrio en ratones heterozigóticos para PTEN. Recientemente se ha comunicado que los pacientes con NSCLC con PTEN-nulo tenían una peor SG. Se sabe que las mutaciones de PTEN aparecen con frecuencia en los gliobastomas y acelera la progresión tumoral (sobre todo en GM). Actualmente no hay agentes eficientes para activar PTEN.

Mecanismos de resistencia a trastuzumab Activación de la señalización (Down-stream): Déficit de PTEN o activación de Akt.

La sobre-espresión de Erb-B2 conduce a su activación por autofosforilación (P); este estado activo se mantiene por el reclutamiento de Src cinasa y PI3K por parte del receptor. La activación de PI3K conduce a la activación de la vía proto-oncogénica de señalización Akt-mTOR (mammalian target of rapamycin) a través de PIP3 (fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato). Nagata et al demuestran que Src activo puede inactivar PTEN mediante la fosforilación de su carbono terminal, ocasionando un aumento de los niveles y activación de PIP3 y una posterior activación de PI3K. Nagata Y et al. Cancer Cell. 2004; 6: 117-27

Cuando trastuzumab se une a Erb-B2 se inactiva por mecanismos desconocidos de Src, lo que libera PTEN que antagoniza la activación de la vía de señalización PI3K-Akt-mTOR. La combinación de trastuzumab con inhibidores de m-TOR podría bloquear esta vía a dos niveles. Niveles bajos de PTEN o mutaciones de Akt se han asociado a resistencia a trastuzumab. Nagata Y et al. Cancer Cell. 2004; 6: 117-27

Anticuerpos monoclonales vs pequeñas moléculas inhibidoras de TK Ac Mo Unión extracelular al receptor Pueden inactivarse por receptores mutados o truncados a los que no puedan unirse La saturación del ligando podría anular la eficacia PM I TK Inhiben el dominio kinasa intracelular Activan formas mutadas de ErbB-1 y truncadas de ErbB-2 Las concentraciones del ligando no interfieren necesariamente con su efecto inhibidor Both monoclonal antibodies (MoAbs) and small-molecule tyrosine kinase inhibitors can potentially block signaling through the ErbB receptors, and both classes of inhibitors are currently in clinical development and testing. However, there are important differences in the mechanisms of action that can have clinical consequences. Monoclonal antibodies bind to the extracellular portion of the receptor. They might block signaling by a number of mechanisms, including prevention of ligand binding or receptor dimerization, downregulation of surface receptor expression, modulation of downstream signaling, and/or triggering of immune system-mediated cytotoxicity. However, since the epitope the antibody binds is contained within the extracellular domain, it might not be present on receptors with a mutated or truncated extracellular domain. In addition, elevated local levels of ligand can potentially saturate receptor binding sites and diminish the effectiveness of MoAbs. In contrast, small-molecule tyrosine kinase inhibitors work inside the cell and directly target the kinase domain. They act by blocking receptor autophosphorylation and activation, thereby preventing subsequent downstream signaling events. Since these molecules work at the level of the kinase domain, they are active against receptor isoforms that contain mutated or truncated extracellular domains such as EGFRvIII or processed ErbB2. In addition, the small-molecule inhibitors are likely to be effective even in the presence of elevated concentrations of ligand.

Razones para inhibir múltiples miembros de la familia ErbB Los receptores ErbB inician las señales de transducción a través de múltiples interacciones (homo y heterodimerización). La inhibición de un solo receptor puede no ser suficiente para una óptima inhibición del crecimiento celular tumoral. The propensity of ErbB family members to homodimerize and heterodimerize means that signaling occurs through multiple receptor combinations, potentially within the same cell. Inhibition of a single receptor can block signaling through homodimers containing that protein, but might not completely shut down signaling through heterodimers and is unlikely to affect signaling through complexes that do not contain that particular family member. This suggests that in tumor cells expressing multiple ErbB family members, growth or survival signals might still be transmitted. Thus, targeting multiple ErbB receptors might be a more potent way to block this signaling pathway.

Mecanismo de Acción: Trastuzumab HER2 HER3 HER2 HER4 HER1/EGFR TK X TK TK TK PI3K/ AKT Aumenta la función de PTEN Apoptosis (PI3/AKT) P P P Supervivencia celular CoA CoR TF

Mecanismo de acción: Lapatinib HER2 HER3 HER2 HER4 HER1/EGFR TK X TK TK TK Ras/ Raf/ MEK/MAPK PI3K/ AKT Lapatinib Lapatinib Supervivencia celular Proliferación

Sólo una subpoblación de tumores HER2+ responden a trastuzumab Mecanismos moleculares de resistencia a trastuzumab Mecanismo Ejemplo Ligandos de factores de crecimiento (TGF-α, β-celulina, heregulina, neuregulina) HER2/HER3 heterodímeros Sobre-epxresión de IGF-1R Sobre-epxresión de c-MET Sobre-epxresión de VEGF Pérdida de función de PTEN Aumento de la actividad de PI3K-AKT Disminución de la regulación de p27 Presencia del receptor truncado p95HER2 Señalización compensatoria: se aumenta la señalización desde otros miembros de la familia HER Señalización compensatoria: se aumenta la señalización desde otros tipos de receptores Alteración de la señalización posterior El agente terapéutico no reconoce la diana molecular: se interrumpe la interacción entre HER2 y AcMo Nahta, R and Esteva, FJ. Breast Cancer Res 2006

PTEN Las células de cáncer de mama TN son sensibles a inhibidores de MEK y los tumores de mama TN presentan activación de Ras. La inhibición de MEK induce aumento compensatorio en PI3K/Akt, principalmente en células con pérdida de PTEN. Mirzoeva et al. Clin Cancer Res, 69: 565, 2008. Saal et al. Nat Genetics 40: 102, 2007. La inhibición combinada de PI3K y MEK es eficaz en todos los modelos preclínicos de cáncer de mama TN. Hoeflich et al. Clin Cancer Res. 15: 4649,2009

Implicaciones de los recientes avances en la investigación de PI3K/PTEN Es una vía crítica en cáncer de mama. Los activadores e inhibidores de esta vía están siendo investigados. La comprensión de los mecanismos de sobre y retroalimentación y de las vías alternativas es crucial para poder desarrollar fármacos eficientes.

PTEN Los cánceres de mama TN presentan activación de Ras/MEK/MAPK y frecuentemente pérdida de la función de PTEN. Este subtipo de tumor representa el mejor grupo para una prueba inicial de una combinación de inhibidores de PI3K y MEK en pacientes con cáncer de mama.

Nuevos hallazgos en PI3K/PTEN P-REX2a Rak PTEN PI3K Akt Cáncer Yim et al. Cancer Cell, 2009:15; 304-314. Fosforila PTEN Estabiliza sus niveles Sobreexpresado bloquea el tumor Fine B et al. Science, 2009:325; 1261-5. Se une e inhibe PTEN Estimula el crecimiento tumoral en cooperación con PI3K mutado INPP4B SGK3 Vasudevan et al. Cancer Cell, 2009:16; 21-32. Regula la casacda PDK1/PI3K PI3K mutado puede usar SKG3 en vez de Akt Gewinner et al. Cancer Cell, 2009;16: 115-125. Su pérdida aumenta la actividad de Akt y el crecimiento tumoral LOH en cáncer de mama basal

¿Qué diana? Apoptosis Proliferación Angiogénesis Metástasis Shc Grb2 PI3-K Sos-1 Ras AKT Raf MEKK-1 MEK mTOR MKK-7 ERK JNK

¿Qué diana? Shc Grb2 PI3-K Sos-1 Ras AKT Raf MEKK-1 MEK mTOR MKK-7 ERK JNK

Serebriiskii and E. Golemis, Fox Chase Cancer Center. Sos-1 Ras MEKK-1 MEK Shc PI3-K Raf MKK-7 Grb2 AKT JNK ERK Serebriiskii and E. Golemis, Fox Chase Cancer Center.

Dónde está la diana Sos-1 Ras MEKK-1 MEK Shc PI3-K Raf MKK-7 Grb2 AKT JNK ERK Serebriiskii and E. Golemis, Fox Chase Cancer Center.

La perspectiva del ingeniero EGF La perspectiva del ingeniero EGFR

Ensayo Fase II neoadyuvante: Trastuzumab 3 semanas trastuzumab/docetaxel 12 semanas Inicial S1 S3 Lapatinib 6 semanas trastuzumab/docetaxel 12 semanas Inicial S2 S4 S6 Respuesta Patológica

Respuesta Patológica Es evaluada tras completar el tratamiento neoadyuvante. Definición de pCR: Desaparición completa de cáncer invasor o mínimos focos (<0.5 cm) de enfermedad residual.

Biomarcadores Apoptosis (CC3) Proliferation (Ki67) p-42/44 MAPK High PTEN Low PTEN p-AKT

Características de las pacientes Trastuzumab (N=35) Lapatinib (N=49) Edad mediana (rango) 53.5 (33-69) 53.7 (29-83.5) Tamaño mediano, cm (rango) 10 (4, 25) 8 (2.5, 30) Biomarcadores ER positivo PR positivo 7 (20%) 6 (17%) 13 (26%) 11(22%)

Eficacia clínica de Lapatinib (N=40): Tumores grandes: T tamaño: mediana 10 cm (rango 2.5, 30) 12 pacientes (37%) con Ca inflamatorio Tras 6 semanas de Lapatinib: Mediana de disminución –50% (0, -100%, p=0.001) CR: 6% (2/33) PR: 76% (25/33) SD: 18% (6/33) PD: 0% (0/33) The median tumor size was large at 10 cm, which is the size of a large orange. Ten patients had inflammatory breast cancer. After 6 weeks of single agent Trastuzumab, tumors regressed with a median decrease of 60%. Approximately 60% had clinical partial response defined as a 50% reduction in tumor size, 20% of patients had some clinical response, and the remaining 20% had stabilization of disease. No cancers progressed during this 6 week period. } 82% (27/33)

Respuesta Patológica Completa (pCR) Con T, pCR de 34% (11/32) Con L, pCR de 68% (23/34)

Apoptosis Trastuzumab: Lapatinib: Aumento Sin cambios P=0.03 P=NS 15 10 10 Apoptotic Index Apoptotic Index 5 5 Initial Week 1 Week 3 Initial Week 2 Week 4 Week 6

Proliferación: Ki67 Trastuzumab: Sin cambios Lapatinib: Disminución de Ki67 100 100 P=NS P<0.0001 90 90 80 80 70 70 60 60 Ki67(%) 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 Initial Week 1 Week 3 Initial Week 2 Week 4 Week 6

p-MAPK Trastuzumab Lapatinib P=NS P=0.02 10 10 8 8 6 6 4 4 2 2 Initial Initial Week 2 Week 4 Week 6 Initial Week 1 Week 3

p-AKT Trastuzumab Lapatinib P=NS P=NS 2 4 6 8 10 Initial Week 2 Week 4 2 4 6 8 10 Initial Week 2 Week 4 Week 6 2 4 6 8 10 Initial Week 1 Week 3 P=NS P=NS

Resumen de resultados: Trastuzumab vs Lapatinib Induce apoptosis probablemente a través de la vía PI3/AKT Sin efecto sobre proliferación (Ki67 or p-MAPK) Lapatinib: Disminuye Ki67 Disminuye p-MAPK Sin efecto sobre apoptosis

Resumen de resultados: Trastuzumab vs Lapatinib Induce apoptosis probablemente a través de la vía PI3/AKT Sin efecto sobre proliferación (Ki67 or p-MAPK) Lapatinib: Disminuye Ki67 Disminuye p-MAPK Sin efecto sobre apoptosis Diferentes mecanismos de acción para T vs. L = ¿Diferentes biomarcadores predictivos?

Trastuzumab y vía PI3K activada: PTEN disminuido pCR: 15% (2/13) Non pCR: 85% (11/13) PI3KCA-mut pCR: 20% (2/10) Non pCR: 80% (8/10) PTEN disminuido/PI3KCA-mut pCR: 18% (4/22) Non pCR: 82% (18/22) } p=0.015 PTEN disminuido/PI3KCA mutado PREDICE RESISTENCIA A TRASTUZUMAB

Lapatinib y vía PI3K activada: PTEN disminuido pCR: 100% (12/12) Non pCR: 0% (0/0) PI3KCA-mut pCR: 60% (3/5) Non pCR: 40% (2/5) PTEN disminuido/PI3KCA-mut pCR: 87% (13/15) Non pCR: 13% (2/15) } p=0.03 p=1.00 } } p=0.04 PTEN disminuido PREDICE LA RESPUESTA A LAPATINIB

PTEN disminuido/PI3KCA-mut: Trastuzumab Lapatinib %, (N) pCR 18% (4/22) 87% (13/15) Non pCR 82% (18/22) 13% (2/15)

PTEN disminuido/PI3KCA-mut: Lapatinib Trastuzumab %, (N), Lapatinib %, (N) pCR 18% (4/22) 87% (13/15) Non pCR 82% (18/22) 13% (2/15)

PTEN disminuido/PI3KCA-mut Trastuzumab (N), % Lapatinib pCR 18% (4/22) 87% (13/15) Non pCR 82% (18/22) 13% (2/15) Análisis de regresión logística entre PTEN disminuido/PIK3CA-mut y respuesta al tratamiento, p=0.0016

Conclusiones Trastuzumab Induce apoptosis Usa la vía PI3/AKT PTEN disminuido/PIK3CA-mut predice resistencia Lapatinib Disminuye Ki67 Usa la vía RAS/MAPK PTEN disminuido predice respuesta

Lecciones de los ensayos de neoadyuvancia Los ensayos neoadyuvantes de tamaño medio con nuevos fármacos son posibles en cáncer de mama. Pueden proporcionar una decisión de “adelante o alto” antes de proceder a un ensayo (carísimo) fase III. Es relativamente fácil obtener biopsias de alta calidad en casi el 100% de estas pacientes. El perfil molecular de los tumores en esta situación permite la investigación de biomarcadores asociados a la respuesta que puedan ser usados posteriormente en la selección de pacientes. Algunos datos (como Ki67) procedentes de biopsias realizadas poco después del inicio del tratamiento tienen correlación con la evolución clínica.

GRACIAS

ALTTO Study Design * * = weekly paclitaxel x 12w; HER2+ invasive breast cancer Centrally-determined HER2+ Surgery, complete (neo)adjuvant anthracycline-based chemotherapy (approved list) LVEF  50 1:1 RANDOMIZATION (N=8000) * Trastuzumab for 1 yr Lapatinib for 1 yr Trastuzumab for 3 mo Trastuzumab 3-weekly + lapatinib for 1 yr 6 wk break Lapatinib x 7.5 mo * = weekly paclitaxel x 12w; per investigator’s discretion. PIs. M Piccart, EA Perez 50