Enzimas de restricción tipo II Las enzimas de restricción son generadas naturalmente por muchas especies bacterianas Protegen a las bacterias de invasión de DNA extraño, especialmente por bacteriofagos. Muchos cientos de enzimas están disponibles comercialmente. Enzimas de restricción tipo II
Estas enzimas se unen a secuencias específicas Estas son típicamente palindrómicas Por ejemplo , el reconocimiento de EcoRI es 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Algunas enzimas digieren el DNA en “fragmentos pegajosos” Otras generan extremos romos.
Pasos para la clonación de un Gen 1. seleccionar el vector Figure 19-6 A diagram of the plasmid pUC18 showing the polylinker region, located within a lacZ gene. DNA inserted into the polylinker region disrupts the lacZ gene, resulting in white colonies that allow direct identification of bacterial colonies carrying cloned DNA inserts.
2. Digerir el vector y el DNA blanco con la misma enzima de restricción DNA recombinante
Transformación Bacteriana. 3. Transformar células bacterianas Transformación Bacteriana. Células competentes
DNA copia (cDNA) Cola de poli A
Electroforesis en gel La electroforesis de ácidos nucleicos separa a los fragmentos de acuerdo a su tamaño. Fragmentos pequeños migran más rápido que fragmentos grandes.
Separación del DNA por geles de agarosa Figure 10-27 Electrophoretic separation of a mixture of DNA fragments that vary in length. The photograph shows an agarose gel with DNA bands corresponding to the diagram.
Geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio
Hibridación y reconocimiento de secuencias con alta homología
Marcaje de un fragmento de ADN
Southern y Northern blot
Western blot
Bibliotecas genómicas
Bibliotecas de cDNA
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificación es exponencial
Para poder amplificar este segmento de ADN, diseñar los primers o cebadores que son necesarios para la amplificación
Usos del PCR
Secuenciación del DNA
Microarreglos para diferenciar la expresión de los genes
Proteómica