Q-PCR

Métodos de cuantificación de expresión génica Cuantificación Semi-cuantitativa Cuantificación cuantitativa

Menor eficiencia, se afecta la cuantificación . Semi-cuantitativa Menor eficiencia, se afecta la cuantificación . Resultados inconsistentes y poco reproducibles Estudios cualitativos (técnica sencilla)

Cuantifica en la fase exponencial lineal Cuantitativa Cuantifica en la fase exponencial lineal Mucho más eficiente confiable y reproducible.

El Ct se usa como referencia para determinar el nivel de expresión

¿Para qué quiero cuantificar? ¿Cuál es el objetivo? ¿Para qué quiero cuantificar? ¿Qué sensibilidad de cuantificación necesito? ¿Cuáles son mis recursos? ¿Qué quiero cuantificar? ¿Cuántos genes voy a cuantificar? Las respuestas guiarán a las técnicas, reactivos, análisis y metodologías a las cuales debo orientarme ya que hay diferentes caminos para seguir.

Métodos de cuantificación Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa Se utiliza una curva estándar Con o sin curva estándar

Cuantificación Absoluta Para cuantificar utiliza curvas de calibración. Permite estimar el número exacto de copias del transcripto de interés.

Cuantificación Absoluta mínimo 4 puntos. No se puede extrapolar por fuera del rango.

Cuantificación Absoluta

Cuantificación Relativa Permite determinar el número relativo de copias de un transcripto Requiere una normalización de los datos que se lleva a cabo con un gen/es control (housekeeping o factores constitutivos). Dos tipos: con curvas estándar y sin curvas estándar

1) 2) 3) 11,5/9,6 = 1.198 3,2/4,8 = 0,666 1,198/0,666 = 1,799 La normalización me permite comparar la expresión del gen de interés sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión.

Sin curvas estándar control Método de análisis: 1º delta Ct 2º delta delta Ct 32-23 =9 5-9 = -4 3º =16 28-23 = 5

Toma de muestras y Extracción de RNA Consideraciones a tener en cuenta: Diseño experimental, variabilidad de la técnica. Integridad del RNA, tomar en cuenta en todos los pasos del proceso. Fácilmente degradable. Presencia de RNAsas. Toma de muestras, tejido y guardado. Materiales, condiciones. Extracción de RNA Materiales, condiciones, procedimiento, duración y almacenaje. Presencia de RNAsas. Reactivos (PureLink, Trizol –Invitrogen-). Purificación

Objetivo: Eliminar restos de DNA genómico. Tratamiento con DNAsa Objetivo: Eliminar restos de DNA genómico. RNA 5ul 30´ a 37º C 10x Reaction Buffer 1ul H20 3ul DNAse + EDTA 10´ a 65º C

Repeticiones de la RT. $$$ Retro Transcriptasa La enzima Paso crítico en cuanto a la variabilidad que puede generar este proceso para la cuantificación futura. Contaminaciones. Repeticiones de la RT. $$$ RNA+H20 10 ul 5´a 65º C Oligo dt 1ul dNTPs 1 ul SS II RT 1ul 50´ a 42º C   15´ a 70º C Ya tenemos el cDNA Ventajas y desventajas Reproducibilidad

Cuantificación semi cuantitativa