TECNICAS DEL DNA RECOMBINANTE Dra. Eugenia Jedlicki C. noviembre 2007

UN GEN (O UN FRAGMENTO CUALQUIERA DE ¿COMO SE PUEDE SEPARAR ESPECIFICAMENTE UN GEN (O UN FRAGMENTO CUALQUIERA DE DNA) A PARTIR DEL GENOMA COMPLETO DE UN ORGANISMO? ¿

Número de bases Número de genes E.coli 4 x 10 3 Kb 4.000 GENOMAS Número de bases Número de genes E.coli 4 x 10 3 Kb 4.000 Ser Humano 3 x 10 6 Kb 25.000

CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION A UN VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN UN HOSPEDERO (OBJETIVO: PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE GENERACION DE FRAGMENTOS DE DNA A PARTIR DE DNA CROMOSOMAL OBTENCION DEL cDNA

ENZIMAS DE RESTRICCION _ ENZIMAS BACTERIANAS (MECANISMO DE PROTECCION) _ ACTIVIDAD ENDONUCLEASICA: CORTAN ENLACE FOSFODIESTER INTERNO EN DNA DOBLE HEBRA _ RECONOCEN SECUENCIAS ESPECIFICAS (4, 6, 8 pb) _ DEJAN EXTREMOS COHESIVOS O ROMOS

Enzimas de Restricción

Productos generados por enzimas de restricción extremos cohesivos EcoRI 5’…GAATTC…3’ 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAAG…5’ 3’…CTTAA G…5’ PstI 5’…CTGCAG…3’ 5’…CTGCA G…3’ 3’…GACGTC…5’ 3’…G ACGTC…5’ extremos romos HaeIII 5’…GGCC…3’ 5’…GG CC…3’ 3’…CCGG…5’ 3’…CC GG…5’

Electroforesis en geles Aplicación de un campo eléctrico Separación através de la matriz del gel Visualización de los fragmentos de DNA Separa fragmentos de DNA por tamaño 8

Stained with ethidium bromide (EtBR) to Visualize the DNA Agarose Gel Stained with ethidium bromide (EtBR) to Visualize the DNA 1000 bp 700 bp 600 bp 500 bp

CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS 1) OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION AL VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN UN HOSPEDERO (PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

Creación de moléculas de DNA Recombinante in vitro 5’ ...GAATTC... ...GAATTC... 3’ 3’ ...CTTAAG... ...CTTAAG... 5’ Eco RI Eco RI Separation of restriction fragments (P) -OH 5’ G 3’ CTTAA (P) -OH 5’ G 3’ CTTAA OH AATTC 3’ G 5’ anneal OH (P) AATTC 3’ G 5’ 5’ GAATTC 3’ CTTAAG DNA Ligase Recombinant DNA

FORMACION DNA RECOMBINANTE RECOMBINACION DE FRAGMENTOS DE DNA EN UN GENOMA PEQUEÑO (VECTOR) 1.- VECTOR: VEHICULO EN EL CUAL DNA DE INTERES ES SELECTIVAMENTE AMPLIFICADO 2.- HOSPEDERO: ASEGURA MANTENCION Y AMPLIFICACION DE DNA RECOMBINANTE

insertado en un plasmidio Fragmento de DNA libre Fragmento de DNA insertado en un plasmidio Cromosoma 1ª división celular 2ª división celular

CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE CLONAMIENTO _ ORIGEN DE REPLICACION INDEPENDIENTE DEL DNA GENOMICO _ SITIOS UNICOS DE RESTRICCION _ MARCADORES DE SELECCION

CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION AL VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION DEL VECTOR RECOMBINANTE EN UN HOSPEDERO (OBJETIVO: PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

el concepto de “genoteca” Una genoteca es una colección representativa de fragmentos de DNA de un organismo contenidos en clones individuales. Deben estar presente todos los fragmentos obtenidos de la digestión del DNA cromosomal Dos tipos de genotecas: - cDNA - DNA genómico

OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE GENERACION DE FRAGMENTOS DE DNA A PARTIR DE DNA CROMOSOMAL OBTENCION DEL cDNA

cDNA library construction 5’ AAAAA 3’ mRNA (all mRNAs in cell) anneal oligo(dT) primers of 12-18 bases in length 5’ AAAAA TTTTT 3’ 5’ 3’ add reverse transcriptase and dNTPs 5’ 3’ AAAAA TTTTT 3’ 5’ cDNA

Genoteca de cDNA Sólo secuencias codificantes Secuencias de genes tejido específicos

CLONAMIENTO DE UN GEN ETAPAS OBTENCION DEL DNA CORRESPONDIENTE UNION AL VECTOR (DNA VEHICULO): OBTENCION DEL DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN UN HOSPEDERO (PERPETUARLO Y AMPLIFICARLO) 4) RASTREO (SCREENING): IDENTIFICACION DE COLONIAS QUE CONTIENEN DNA RECOMBINANTE

RASTREO (SCREENING): DETECCION DEL CLON QUE POSEE EL GEN DE INTERES METODO DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS METODO INMUNOQUIMICO

Hibridación Las hebras de DNA hibridan por complementaridad de bases ETAPAS Desnaturar el DNA doble hebra por calor y dejar enfriar Hebras complementarias vuelven a aparearse Sonda: fragmento de DNA complementario a secuencia génica en estudio. Debe marcarse para su posterior detección 18

Desnaturar Fijar a un soporte Hibridar con una sonda radiactiva P* P* Lavar P* P* P* P*

RASTREO (SCREENING): DETECCION DEL CLON QUE POSEE EL GEN DE INTERES METODO DE HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS METODO INMUNOQUIMICO

VECTOR DE EXPRESION

Vector de expresión en bacterias

Expresión de proteínas en bacterias cDNA clonado Expresión de proteínas en bacterias Vector de expresión Inicio de la transcripción ATG cDNA Represor lac IPTG RNA Proteina

Antibody screening

DNA RECOMBINANTE EN MEDICINA ANTICOAGULANTES FACTORES SANGUINEOS ERITROPOYETINA FACTORES DE CRECIMIENTO HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA INSULINA HUMANA INTERFERONES INTERLEUKINAS ANTICUERPOS MONOCLONALES VACUNAS

ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

TECNICA DE SOUTHERN

ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

Técnica de Sanger para secuenciar el DNA: el DNA se denatura: hebras simples el partidor se hibrida a la hebra molde el DNA es sintetizado usando DNA polimerasa 5’ 3’ 3’ |||||||||||||||

Polinucleotídicas crecen por Adición de nucleótidos al Extremo 3´ OH FUNDAMENTO Las Cadenas Polinucleotídicas crecen por Adición de nucleótidos al Extremo 3´ OH

Dideoxy Sequencing Fred Sanger - 1977

Todos los posibles productos ddATP DNA dNTPs ddTTP DNA dNTPs ddGTP DNA dNTPs ddCTP DNA dNTPs 5’ 3’ ||||||||||||||| A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C T A cada fragmento termina en ddA T A G T A Todos los posibles productos de la reacción conteniendo ddATP T A G T A C A T A G T A C A G T A T A G T A C A G T A G T T C A T A G T A C A G T A G T T C A G A

SECUENCIACION DEL DNA METODO ENZIMATICO

A T G C 5’ 3’ ||||||||||||||| A T C A T G T C A T C A A G T C T A G C A C A T G C fragmentos largos TAGTACAGTAGTTCAGATCGTG fragmentos cortos

migración graphics taken from Cold Spring Harbor Laboratory web site: darwin.cshl.org/shockan.html

ENSAMBLAR LAS SECUENCIAS: lertsggrdxz cdfdwggzappu rdxzacdfdw dfjnmlerts

LAS SECUENCIAS ENSAMBLADAS dfjnmlerts lertsggrdxz rdxzacdfdw cdfdwggzappu dfjnmlertsggrdxzacdfdwggzappu

SORPRESA No.1 1 2 3 4 Tropinin T Smooth muscle Ejemplo de splicing 1 2 3 4 Tropinin T Ejemplo de splicing alternativo Smooth muscle Otros tejidos

Sólo 2% del genoma son genes. SORPRESA No. 2 98% del genoma Gen 1 Gen 2 Sólo 2% del genoma son genes.

Somos casi idénticos (2% de diferencia) a los chimpancés. SORPRESA No. 3 Somos casi idénticos (2% de diferencia) a los chimpancés.

Hay sólo 0,1% de variación genética entre todos los seres humanos. SORPRESA No. 4 Hay sólo 0,1% de variación genética entre todos los seres humanos. Pero 0,1% de 3.000.000.000 bases = 3.000.000 bases

ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

ds DNA TECNICA DE PCR ETAPAS Etapa 1 Desnaturación Etapa 2 Alineamiento Etapa 3 Extensión 19

Aplicaciones del PCR Clonamiento del DNA Mutagénesis In-vitro Identificación de genes Medicina forense Detección de mutaciones (enfermedades genéticas) 22

ALGUNAS TECNICAS DE USO FRECUENTE EN TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINATE SOUTHERN NORTHERN WESTERN SECUENCIACION DNA PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) MICROARREGLOS (MICROARRAY) 18

Célula normal Célula cancerosa mRNA Gen expresado sólo en la célula normal Gen expresado sólo en la célula cancerosa Gen expresado en ambas células Computador lo cambia a negro

Cy3 Cy5 Cy5/Cy3 log Cy5/Cy3

Llevando la Medicina Correcta al Paciente Correcto Pacientes que responden sin un serio efecto lateral Pacientes que responden pero que sufren un serio efecto lateral Diagnóstico Perfiles Medicina Correcta Paciente Correcto Llevando la Medicina Correcta al Paciente Correcto

el diseño de drogas personalizadas Variaciones en los genes entre diferentes personas dan cuenta de diferentes respuestas a un mismo tratamiento terapéutico. Un nuevo concepto en la medicina: el diseño de drogas personalizadas Proteína X de persona A Proteína X de persona B

el diseño de drogas personalizadas Variaciones en los genes entre diferentes personas dan cuenta de diferentes respuestas a un mismo tratamiento terapéutico. Un nuevo concepto en la medicina: el diseño de drogas personalizadas Proteína X de persona A Proteína X de persona B la droga no es funcional

el diseño de drogas personalizadas Variaciones en los genes entre diferentes personas dan cuenta de diferentes respuestas a un mismo tratamiento terapéutico. Un nuevo concepto en la medicina: el diseño de drogas personalizadas Proteína X de persona A Proteína X de persona B Diseño de una droga específica