TECNICAS EN BIOLOGIA CELULAR

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

Técnicas para estudiar el ADN Extracción de ADN Aislamiento de genes Selección de genes Amplificación o Clonación Estudios Secuenciación Mutaciones

ADN RECOMBINANTE

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.

Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Las enzimas de restricción y los vectores moleculares, se coordinan para aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e insertarla en el ADN de otro.

Enzimas de restricción Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño. Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. Las regiones donde cortan el ADN se llaman palindrómicas Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.

Las 2 moléculas de DNA se digieren con la misma endonucleasa de restricción La enzima corta y produce extremos complementarios que se aparean La ligasa une las hebras de DNA y se forma el DNA

Ejemplos de Enzimas de Restricción Enzimaa Fuente Sitio de reconocimientob BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC EcoRI Escherichia coli RY13 GAATTC HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC HpaII CCGG MboI Moraxella bovis GATC NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC TaqI Thermus aquaticus TCGA aLa enzimas tiene el nombre de acuerdo a la especie de la que se aislaron, seguida de un número para distinguir las diferentes enzimas aisladas del mismo organismo (ej. HpaI and HpaII). b Los sitios de reconocimiento muestran la secuencia en una sola de las hebras del DNA. “N” representa cualquier base

Electroforesis Separación de los fragmentos obtenidos con endonucleasas de restricción

Electroforesis Visualización: se tiñen (bromuro de etidio) y fotografían

VECTORES PLÁSMIDOS BACTERIOFAGOS COSMIDOS BACs YACs Son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospederas. Se utilizan con frecuencia tres tipos de vectores de clonación: PLÁSMIDOS BACTERIOFAGOS COSMIDOS BACs YACs

Plásmidos Los plásmidos son secuencias de ADN de bacterias, extracromosómicas que tienen la capacidad de reproducirse autónomamente y, algunos, de pasar de una célula a otra. llevan consigo genes que confieren particularidades fenotípicas a las bacterias que los contienen, como la resistencia a los antibióticos. Pueden transportar hasta 10kb

BACTERIOFAGOS Los bacteriófagos son unos virus que infectan a las bacterias. Algunos de ellos (Lambda y M13). Pueden transportar hasta 20kb. pueden tener efecto lìticos o lisogènicos en las bacterias.

COSMIDOS Los cósmidos son unos vectores híbridos entre un plásmido, que proporciona la resistencia a los antibióticos, y una región del ADN de un bacteriófago llamada "cos" que le otorga sus particulares características. Pueden transportar hasta 50kb

Cromosomas artificiales de bacterias BACs: Es un vector usado para clonar fragmentos de ADN (100 a 300 kb), basado en el plásmido factor F, encontrado de modo natural en las bacterias de E.coli.

Cromosomas artificiales de levaduras Llamados YAC (yeast artificial chromosome) Transporta 200 a 3,000 kb. Posee Origen de replicación Gen de resistencia a ampicilina Origen de replicación en levaduras

CLONACIÓN DE ADN RECOMBINADO Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente idénticas. Para tener gran cantidad y fácil disponibilidad del ADN de interés, el vector se inserta dentro de bacterias (E. coli), las cuales crecen fácil y rápidamente. O sea, la bacteria se utiliza como "multiplicadora" del vector, y por ende del inserto de interés.

HIBRIDACION MOLECULAR Técnica que permite la formación de una cadena complementaria de ADN-ARN Esto se logra con cambios de temperatura Al elevar la temperatura se desnaturaliza el ADN (separan las cadenas) Al bajar la temperatura se vuelve a aparear con una cadena complementaria. Algunas se aparean con ARN (hibridaciòn)

HIBRIDACION MOLECULAR

ADN complementario (cDNA) Es una fuente alternativa para clonar ADN de interés Se utiliza ARNm (sin intrones) como molde y una transcriptasa inversa Puede obtenerse bibliotecas de ADNc (genes activos)

Secuenciación de ADN Determinar el orden lineal de las bases en el ADN Método de Sanger Utiliza dideoxinucleótidos Separa fragmentos por electroforesis

PCR Reacción en cadena de la polimerasa Método más rápido para aislar y clonar (amplificar) ácidos nucleicos En un termociclador Reactivos: Taq polimerasa (polimerasa termorresistente) dNTP´s Primers (cebadores) para iniciar síntesis de DNA

Secuencia de pasos en PCR 95ºC: Desnaturalización de ADN 60ºC: Unión de primers a las regiones terminales del gen de interés 72ºC: Replicación por la Tac polimerasa

FISH Sonda de ADN radiactiva se hibrida con ADN desnaturalizado Diagnóstico: evidencia una mutación puntual o deleción

Microarreglos o chip de ADN Permiten monitorear simultáneamente la expresión de miles de genes (25000) Utiliza sondas de ADN (gen individual) Se hibrida con ADNc Patrones de expresión de genes

Microarreglo

Genomas Se han secuenciado varios genomas (humano 2003) Evolución, fisiología y enfermedad ¿Cuántos genes? ¿Cuándo y en qué tejidos se expresan? 1-2% genoma humano codifica proteínas normalmente ¿Qué proteínas se producen, cómo funcionan e interactúan con otras? Proteómica

Genomas La secuencia de bases entre individuos solo difiere un 0.3% Variaciones: SNPs o polimorfismos de un único nucleótido Utilidad: base genética de enfermedades: Cáncer de colon y mama Diabetes Alzheimer

Ejemplo de aplicación de estas técnicas Producción de insulina humana Producción de hormona de crecimiento humana (antes se obtenía de cadáveres) Vacunas (hepatitis B) Organismos genéticamente modificados (GMO): transgénicos o cisgénicos