ASPECTOS BASICOS DE INMUNOCITOMETRIA DE FLUJO Prof. JOSE LUIS MOLINA OSORIO/UAM/2014 JOSÉ LUIS MOLINA OSORIO / UAM / CITOT./2013

La inmunocitometría de flujo es una metodología que permite obtener información sobre las características y la cantidad de una mezcla de células en suspensión; que al recibir una señal luminosa (luz láser), le producen a ésta modificaciones, que se corresponden con varias de las características celulares. La adición de anticuerpos marcados con fluorocromos permite además identificar antigenos en éstas celulas INMUNOCITOMETRIA DE FLUJO Detección Identificación Contaje Suspension Celular Ac. C /Fluorocromos

ESQUEMA BASICO DE UN INMUNOCITOMETRO DE FLUJO

Tiene muchas aplicaciones, que abarcan desde el diagnóstico clínico (principalmente en el ámbito de la Hematología y la Inmunología), hasta complejos proyectos de investigación en el campo de la biomedicina y de la biología celular en general.

ESQUEMA FUNCIONAL BÁSICO Difracción ………. Frontal (FSC) / Lateral (SSC) Luz Incidente Célula Fluorocromo ……. Color según Fluorocromo ( Intensidad / Amplitud ) Fotosensores (Fotones) Emisión Lumínica Señal Eléctrica (Voltajes )  Señal Digitalizada  Computadora

INMUNOCITÓMETRO DE FLUJO: SEPARADOR CELULAR ACTIVADO POR FLUORESCENCIA DISCRIMINA LAS CÉLULAS CON BASE EN SUS CARACTERÍSICAS FÍSICAS COMO: TAMAÑO COMPLEJIDAD INTERNA (granulosidad) INMUNOCITÓMETRO DE FLUJO: INCORPORA SEÑALES PROVENIENTES DE ANTICUERPOS MARCADOS CON FLUOROCROMOS  IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES CELULARES SEPARADOR CELULAR ACTIVADO POR FLUORESCENCIA CELL- SORTER / F.A.C.S. PERMITE LA SEPARACIÓN Y AISLAMIENTO DE TIPOS CELULARES SEGÚN CARGAS ELECTRICAS SUPERFICIALES ASIGNADAS POR EL EQUIPO.

COMPONENTES DEL CITOMETRO DE FLUJO Sistema Bombeo Líquido: Convierte la suspensión celular en un Flujo Laminar de gotas (células) individuales que van al punto de Incidencia de luz en la cámara de flujo Sistema Optico-Luminoso : Fuente de la luz que incide sobre las células y recoge las señales difractadas y fluorescentes , por un grupo de filtros, lentes, y fotosensores. Sistema Electrónico-Informático : Convierte a señales digitales que son integradas para su visualizacion y presentación gráfica El sistema electrónico convierte todo en señales digitales para almacenar en la computadora

DE LA (S) FLUORESCENCIA DISPERSION LATERAL DISPERSION HACIA ADELANTE COLOR E INTENSIDAD DE LA (S) FLUORESCENCIA

EL USO DE VARIOS LÁSER Y MÚLTIPLES FILTROS Y LENTES PERMITE DETECTAR Y ANALIZAR SIMULTÁNEAMENTE VARIOS PARÁMETROS CELULARES CONJUNTOS 1 ó 2 LÁSER + 4 LENTES  6 PARÁMETROS + FSC + SSC LÁSER ADICIONAL + 6 LENTES  15 PARÁMETROS + FSC + SSC

DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN Los pulsos de “Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitales Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo de listado (almacenamiento multiparamétrico). Presentados como Histogramas y/o Diagramas biparamétricos

Representación biparamétrica en 2D Diagrama de puntos / dot plot - + Representación simultánea de dos parámetros X e Y. X representa el valor de la señal de un parámetro. Y representa el valor de la señal del otro. + + FL-2 Cada punto representa la combinación de valores correspondiente a una célula. El diagrama de puntos representa las distintas poblaciones celulares. La frecuencia celular en una región se estima por el número de puntos en esa región, Una Población celular queda representada como una nube de puntos. manera facil de identificar poblaciones raras. - + - - FL-1 17

ANALISIS POR INMUNOCITOMETRIA DE POBLACIONES DE LINFOCITOS EN TIMO Y BAZO. CD8 CD8 CD4 CD4

F.A.C.S. (Separador Celular Activado por Fluorescencia) LA ASIGNACIÓN DE CARGAS ELÉCTRICAS DIFERENCIALES A LAS CÉLULAS DETECTADAS, SEGÚN EL TIPO DE SEÑAL EMITIDA PERMITE LA SEPARACIÓN AISLAMIENTO Y ALMACENAJE DE GRUPOS CELULARES ESPECĺFICOS DETERMINADOS F.A.C.S. (Separador Celular Activado por Fluorescencia) SEPARACION CELULAR POR CITOMETRIA DE FLUJO

VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO La CMF presenta múltiples ventajas frente al microscópio de fluorescencia y la inmunocitoquímicas, como: - Posibilidad de empleo de multiple marcaje frente a uno solo de la citoquímica y la microscopia de fluorescencia. - Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de tiempo(> 5000 /seg). - Posibilidad de cuantificacion por medio de los canales de medición de fluorescencia. - Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar cantidades mínimas y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales. - Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares. - Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular. - Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad. DESVENTAJA : La citometría de flujo no aporta información sobre la distribución espacial de las células estudiadas.

PROBLEMAS CLÍNICOS ABORDABLES MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO Estudio de la heterogeneidad de las células sanguíneas o de otros tejidos Neoplasias, Tipificación de leucemias / linfomas inmunodeficiencias congénitas y adquiridas Monitorización del efecto de terapia inmunosupresora en pacientes trasplantados Estudio de la ploidia y proliferación celular Estudio de la apoptosis Cuantificación de concentraciones de moléculas solubles Purificación de células antígeno-específicas