Tecnología de ADN Karina Orozco

ADN Es el material genético presente en todas las células y algunos virus ¿Cómo lo estudiamos?

Virus Fagos: infectan bacterias (T-pares, l) Fago virulento: lítico Fago temperado: lisógeno Grandes cantidades en poco tiempo (1011 partículas de fago/ml de cultivo bacteriano Genomas pequeños

Pasos para estudiar el ADN Extracción de ADN Aislamiento de genes Selección de genes Amplificación o Clonación Estudios Secuenciación Mutaciones

Endonucleasas de restricción Enzimas que cortan al ADN en lugares específicos (secuencias palindrómicas) Identificadas en bacterias (defensa contra virus) Puede originar fragmentos: Pegajosos Romos

Ejemplos de Enzimas de Restricción Enzimaa Fuente Sitio de reconocimientob BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC EcoRI Escherichia coli RY13 GAATTC HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC HpaII CCGG MboI Moraxella bovis GATC NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC TaqI Thermus aquaticus TCGA aLa enzimas tiene el nombre de acuerdo a la especie de la que se aislaron, seguida de un número para distinguir las diferentes enzimas aisladas del mismo organismo (ej. HpaI and HpaII). b Los sitios de reconocimiento muestran la secuencia en una sola de las hebras del DNA. “N” representa cualquier base

Electroforesis Electroforesis en gel Electrodo (-) Electrodo (+) Migración del DNA Digestión con Eco RI Separación de los fragmentos obtenidos con endonucleasas de restricción

Electroforesis Visualización: se tiñen (bromuro de etidio) y fotografían

Mapas de Restricción ADN se trata con diferentes endonucleasas de restricción→diferentes tipos de corte. Útil para genomas pequeños (virus, plásmidos)

Vectores de transferencia Medio de transferencia para clonación de genes Ej. Fagos, plásmidos, BACs, YACs

Características de los vectores de transferencia Sitios de corte o de restricción para insertar el gen Un marcador para distinguir la célula transformada Replicación independiente para transmitir o multiplicar el gen Se recuperan fácilmente de la célula huésped utilizando la misma enzima de restricción usada en la inserción

Transferencia del gen Se inserta un fragmento de DNA humano en un vector (fago l) El DNA recombinante resultante se introduce en una célula huésped (E. coli) El fago se replica dentro de la bacteria y produce nuevos fagos con el DNA recombinante (DNA de fago y DNA humano)

bacteriófagos Transbordan segmentos hasta de 15 kb Tiene un sitio de restricción para inserción del DNA Infectan a cultivos de E. coli Cada fago forma una calva única y se aisla cada ADN recombinante

Plásmidos Pequeñas moléculas de DNA circular que se replican independientemente dentro de una bacteria Poseen tres zonas de interés: Origen de replicación Gen de resistencia a antibióticos (ampicilina) Donde se inserta el DNA a clonar Plásmido

plásmidos Manipulación más fácil que con fagos Se tratan el plásmido y DNA con endonucleasa de restricción Se unen con la ligasa Se coloca el plásmido recombinado en célula huesped Se reproducen la bacteria y el plásmido

cósmidos Contiene secuencias de fago l para ser empaquetado dentro de un fago Posee origen de replicación y gen resistencia a antibióticos Transporta DNA de unas 45 kb

cromosomas artificiales de levaduras Llamados YAC (yeast artificial chromosome) Posee Origen de replicación Gen de resistencia a ampicilina Origen de replicación en levaduras Centrómero Marcador Telómeros

Molécula que contiene ADN de fuentes diferentes ADN recombinante Molécula que contiene ADN de fuentes diferentes Moléculas de ADN de fuentes diferentes se tratan con la misma endonucleasa de restricción (digestión) Los fragmentos obtenidos se insertan en el vector de transferencaia y sellan con ADN ligasa Se obtiene el ADN recombinante y se introduce a una célula (transformación o transfección) para clonarlo o amplificarlo Se seleccionan las células con el ADN recombinante de interés (marcador) Se identifican los clones que contienen el ADN de interés (sonda radiactiva de ADN)

Ejemplo de clonación con plásmidos 2. Inserción con DNA ligasa 1. Digestion con enzima de restricción 3. Transformación de celulas huesped 4. Replicación de bacterias y plasmido Manipulación más fácil que con fagos !

ADN complementario (cDNA) Es una fuente alternativa para clonar ADN de interés Se utiliza ARNm (sin intrones) como molde y una transcriptasa inversa Puede obtenerse bibliotecas de ADNc (genes activos)

Ejemplo de aplicación de estas técnicas Producción de insulina humana Producción de hormona de crecimiento humana (antes se obtenía de cadáveres) Vacunas (hepatitis B) Organismos genéticamente modificados (GMO): transgénicos o cisgénicos

PCR Reacción en cadena de la polimerasa Método más rápido para aislar y clonar (amplificar) ácidos nucleicos En un termociclador Reactivos: Taq polimerasa (polimerasa termorresistente) dNTP´s Primers (cebadores) para iniciar síntesis de DNA

Secuencia de pasos en PCR 95ºC: Desnaturalización de ADN 60ºC: Unión de primers a las regiones terminales del gen de interés 72ºC: Replicación por la Tac polimerasa

Secuenciación de ADN Determinar el orden lineal de las bases en el ADN Método de Sanger Utiliza dideoxinucleótidos Separa fragmentos por electroforesis

Genomas Se han secuenciado varios genomas (humano 2003) Evolución, fisiología y enfermedad ¿Cuántos genes? ¿Cuándo y en qué tejidos se expresan? 1-2% genoma humano codifica proteínas normalmente ¿Qué proteínas se producen, cómo funcionan e interactúan con otras? Proteómica

Genomas La secuencia de bases entre individuos solo difiere un 0.3% Variaciones: SNPs o polimorfismos de un único nucleótido Utilidad: base genética de enfermedades: Cáncer de colon y mama Diabetes Alzheimer

Microarreglos o chip de ADN Permiten monitorear simultáneamente la expresión de miles de genes (25000) Utiliza sondas de ADN (gen individual) Se hibrida con ADNc Patrones de expresión de genes

FISH Sonda de ADN radiactiva se hibrida con ADN desnaturalizado Diagnóstico: evidencia una mutación puntual o deleción